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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病,主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的丢失,残存神经元内α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）聚集形成路易小体,同时伴有铁在黑质的特异性聚积。硝化应激可引发多种蛋白质,如parkin蛋白等,发生亚硝基化（S-nitrosylation,SNO）,参与神经退行性疾病的发生及进展。Parkin是一种E3泛素连接酶,介导了铁转运蛋白二价金属离子转运体1（divalent metal transporter 1,DMT1）的泛素化降解。本课题组在前期研究中发现DMT1蛋白水平的高表达是黑质铁聚集的重要原因之一,但对其调控机制尚不清楚。由于硝化应激是PD中较为常见的病理表现,因此,深入探讨parkin蛋白的亚硝基化修饰对DMT1的调控及其机制,对阐明PD中黑质铁聚集的原因具有重要意义。本研究首先在SH-SY5Y细胞上,观察了给予一氧化氮（nitric oxide,NO）供体亚硝基谷胱甘肽（nitrosoglutathione,GSNO）处理后,细胞NO水平、SNO-parkin和DMT1蛋白表达的变化,同时检测了细胞铁摄取功能的改变。给予1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）处理,观察上述指标的变化。然后在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）制备的PD动物模型上,观察黑质SNO-parkin和DMT1蛋白水平的变化。为了进一步阐明parkin的亚硝基化修饰对DMT1调控的分子机制,在SH-SY5Y细胞上,我们观察了parkin蛋白发生亚硝基化修饰对DMT1泛素化水平的影响;以及p53依赖途径中,SNO-parkin对DMT1的调节机制。本研究为阐明PD发生过程中,黑质区DMT1表达增高的原因提供一定的实验依据。实验结果如下:1.在SH-SY5Y细胞上,转染parkin 24 hrs后,DMT1的蛋白水平降低了53.9%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.01）。转染parkin的SH-SY5Y细胞经GSNO处理后,20小时观察到parkin开始发生亚硝基化,24小时parkin的亚硝基化达到峰值。2.高表达parkin的SH-SY5Y细胞经GSNO处理24 hrs后,DMT1的蛋白水平升高了277%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.001）。3.高表达parkin的SH-SY5Y细胞分别经GSNO和MPP+处理24 hrs后,NO水平较对照组分别升高了46.5%和60.2%,差别有高度统计学意义（P<0.01,P<0.001）。给予NOS抑制剂L-NNA预处理后,再给予MPP+处理,NO水平降低了35.1%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.001）。4.高表达parkin的SH-SY5Y细胞经MPP+处理24 hrs后,parkin发生亚硝基化修饰,DMT1的蛋白水平升高了203%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.01）。给予L-NNA预处理后,再给予MPP+处理,DMT1的蛋白水平降低了43.1%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.01）。5.高表达parkin的SH-SY5Y细胞分别经GSNO和MPP+处理24 hrs后,细胞的铁摄取能力均明显增加,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.001）。给予L-NNA预处理后,再给予MPP+处理,细胞的铁摄取能力明显降低,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.001）。6.在转染Myc-DMT1或siDMT1的SH-SY5Y细胞中,分别给予100μM FeSO4处理24 hrs,应用Myc-DMT1高表达DMT1后,可加剧铁导致的细胞存活率下降,与其对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.001）。应用siDMT1抑制DMT1的表达后,可缓解铁导致的细胞存活率的降低,与对照组相比,差别有统计学意义（P<0.05）。7.在MPTP制备的PD小鼠模型中,黑质区SNO-parkin蛋白表达在最后一次注射MPTP后2小时开始升高,并在4小时达到峰值。同时,黑质区DMT1的蛋白水平在4小时明显升高,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.001）。但纹状体区SNO-parkin和DMT1的蛋白水平未观察到变化,与对照组相比,差别无统计学意义（P>0.05）。8.在HEK293T细胞上,共转染Flag-WT-parkin、HA-Ub和Myc-DMT1 24 hrs后,DMT1的泛素化水平明显升高,而经GSNO预处理后,DMT1的泛素化水平明显降低。Flag-C241A-parkin、Flag-C260A-parkin和Flag-C323A-parkin三种突变体分别转染到HEK293T细胞中,经GSNO预处理后,DMT1的泛素化水平均明显降低,与转染Flag-WT-parkin时相似。在HEK293T细胞中共转染突变体Flag-C241A-parkin、Flag-C260A-parkin和Flag-C323A-parkin,经GSNO预处理后,DMT1的泛素化水平无明显变化,未受亚硝基化修饰的影响。9.SH-SY5Y细胞转染parkin 24 hrs后,p53的蛋白水平降低了26.5%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.001）。高表达parkin的SH-SY5Y细胞分别经GSNO和MPP+处理24 hrs后,p53的蛋白水平较对照组分别升高了314%和64.2%,差别有高度统计学意义（P<0.001）。给予L-NNA预处理后,再给予MPP+处理,p53的蛋白水平降低了57.9%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.01）。10.SH-SY5Y细胞转染p53 siRNA后,DMT1的蛋白水平降低了54.6%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P<0.01）。综上所述,在高表达parkin的SH-SY5Y细胞中,GSNO或MPP+处理能够导致细胞内NO水平升高,从而使parkin发生亚硝基化修饰,影响了其泛素连接酶的功能,导致底物DMT1泛素化降解减少,蛋白水平升高,进而增强细胞的铁摄取能力。因此,本研究提示,parkin发生亚硝基化导致DMT1的表达调控异常,抑制parkin的亚硝基化修饰可能作为PD的治疗靶点。