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前言糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见而严重的微血管并发症。其发病机制可能与糖基化终末产物(Advanced glycation endproducts,AGEs)诱导的视网膜微血管内皮细胞损伤有关。AGEs是机体在长期高血糖状态下体内蛋白质的氨基与糖的醛基之间发生的非酶性糖基化反应的终产物的总称。糖尿病视网膜病变时AGEs积聚,与其受体(receptor for AGEs,RAGE)结合,诱导氧化应激,影响细胞内的信号转导,导致内皮细胞功能失调和炎症反应的发生。本文旨在研究糖尿病视网膜病变中AGEs对于大鼠视网膜微血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cells,RMECs)的作用及相关因子的表达。同时由于他汀类(statins)药物不仅具有降低血脂、抑制胆固醇合成的作用,而且也可以改善内皮细胞功能紊乱、提高内皮源性一氧化氮合酶的活性、抗炎、抗氧化、逆转血管重构。本实验也试图探讨他汀类药物和抗氧化剂丙丁酚对血管内皮细胞的保护作用。方法体外培养RMECs,制备糖基化终末产物-糖基化白蛋白(AGE-BSA)。采用Western blot法、RT-PCR法检测不同浓度AGE-BSA及相同浓度AGE-BSA作用不同时间的RAGE、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nicotinamide-adeninedinucleotide phosphate oxidase,NADPH)、血管细胞粘附分子-1(Vascular celladhesion molecular-1,VCAM-1)的表达变化。通过流式细胞仪检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的荧光强度,应用免疫荧光法观察核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化。同时研究了给予普伐他秃?或丙丁酚作用下AGE-BSA诱导的RMECs中RAGE表达的变化。结果随着AGE-BSA浓度的增加和作用时间的延长,RMECs处RAGE mRNA水平、NADPH氧化酶mRNA水平、VCAM-1蛋白表达及ROS的产生逐渐增多,呈剂量和时间依赖效应。无AGE-BSA刺激时,NF-κB主要表达在细胞质;AGE-BSA刺激后NF-κB主要表达在核内,作用30 min时达高峰。AGE-BSA(100 mg/L)作用下RAGE mRNA水平明显升高,分别加入普伐他汀和丙丁酚后RAGE mRNA水平减少,联合应用普伐他汀和丙丁酚时RAGE mRNA水平明显减少。讨论DR是糖尿病最常见、最严重的一种慢性并发症。其发病机制尚不完全清楚,一般认为是由于视网膜微血管系统损伤所致。AGEs在视网膜微血管系统损伤中发挥重要作用。本实验结果表明,RMECs处,AGEs增加时可上调RAGE的表达。RAGE与AGEs结合,相互作用触发细胞内下游信号转导。NADPH氧化酶是由多个亚基组成的酶复合体,在RMECs,AGE-BSA的作用显著地增加了NADPH氧化酶mRNA水平,使其处于活化状态。另外,结果证实检测ROS时,细胞内的荧光强度随着AGE-BSA的浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增强,氧化应激损伤逐渐加重。而应用NADPH氧化酶的抑制剂—apocynin后ROS荧光值下降,说明NADPH氧化酶的活化在RAGE介导的氧化应激中起了重要作用,NADPH氧化酶途径是内皮细胞中ROS的来源之一。ROS在血管内皮细胞的信号转导、基因表达及增殖和凋亡中发挥重要作用。Sulciner等认为NF-κB是内皮细胞内ROS作用的主要靶点,其活化与内皮细胞生存和功能失调有关。本实验应用荧光显微镜检测NF-κB活化,发现AGE-BSA作用于RMECs后NF-κB开始活化,30 min达到高峰,激活的NF-κB从细胞浆内转移至细胞核内DNA特定部位,激活细胞因子、粘附分子及生长因子等引起多种基因的表达协同增加,NF-κB激活是诱导细胞因子产生的关键环节。VCAM-1主要介导单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与内皮细胞的粘附迁移,是血管内皮细胞表面重要的粘附分子。正常情况下,内皮细胞表面黏附分子呈现低表达或不表达,本实验中,VCAM-1随着AGE-BSA作用下表达明显增加,内皮细胞受到损伤加重,炎症发生发展,NF-κB是调控VCAM-1基因表达的重要转录因子之一,在大多数粘附分子基因的启动区存在着NF-κB的结合位点,AGE-BSA诱导的VCAM-1的蛋白表达增加是由依赖于NF-κB的。联合应用普伐他汀和丙丁酚与单独应用两种药物相比也可以使AGE-BSA诱导的RAGE mRNA水平降低更为明显。本实验中也发现联合应用这两种药物效果较好,可能成为糖尿病视网膜病变治疗的一个潜在的治疗策略。结论1.AGE-BSA可以促进RMECs的VCAM-1的表达,并在一定范围内呈剂量及时间依赖效应;2.AGE-BSA可以促进RMECs的RAGE的表达,并在一定范围内呈剂量及时间依赖效应,AGEs和RAGE结合发挥作用;3.NF-κB的活化是其关键环节,同时也有ROS的产生;4.分别应用普伐他汀和丙丁酚可以减少AGE-BSA诱导的RAGE mRNA的水平,二者联合应用效果更佳。