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1997年的诺贝尔医学或生理学奖授予了美国科学家斯坦利·普鲁斯纳,因为他发现了一种新的致病因子,这种致病因子被称为朊蛋白(prion)该缩写名来自全称‘蛋白质感染颗粒’。这种新的致病源由于本身没有基因组而有别于已知的致病源(如细菌、病毒等)。朊蛋白在人和动物可引起遗传性海绵状脑病(TSE)。在动物病中有羊瘙痒症、疯牛病等,在人类可引起雅各布氏病、库鲁病等。羊瘙痒症是最早发现的朊蛋白病,而疯牛病在英国的流行以及新近发现的新变种的人类雅各布氏病引起研究者们对朊蛋白疾病及其致病蛋白的更大关注。研究得知朊蛋白有两种形式,一种为致病形式(PrPsc,sc是瘙痒症的缩写),另一种为组织内正常存在的细胞形式(PrPc,c是细胞型的缩写),这两种蛋白在一级结构的氨基酸序列相同,仅构象有不同。目前普遍接受的朊蛋白疾病发生机制为PrPsc转化PrPc为致病形式,致使越来越多的致病蛋白形成并堆积成越来越大的纤维状聚集物,当致病蛋白聚集到一定程度,造成神经元死亡而使受累脑区呈现海绵样空洞,这也就是为什么用海绵样脑病来描述所有的肮蛋白疾病。 细胞型肮蛋白(PrPc)在组织内分介广泛、在物种问高度保守并且在肮蛋白疾病的发生中不可或缺,这些特点决定了它在肮蛋白疾病研究中的重要地位。因为对正常形式蛋白的透彻了解可以提供疾病发生和治疗的理论基础。目前己有的关于细胞型肮蛋白的研究包括蛋白在正常脑内的分介、生理功能以及对其受体(或结合蛋白)的确定。研究表明PrPc发挥正常功能需要与另一蛋白结合协助作用,因此对其受体的分离和鉴定也有助于进一步探索其生理功能。 研究目的:分离和鉴定细胞型肮蛋白的受体或者结合蛋白。 方法:()以融合蛋白 PrPAP通过瞬时表达克隆法筛选两个 cDNA文库,或者通过与胚胎脑的结合实验筛选有丰富结合蛋白的脑区,以图构建cDNA文库并进行表达克隆的筛选。检测一些粘附分子是否为PrP结合分子,筛选雪旺氏、少突胶质细胞系、原代培养呈形胶质细胞。海马神经元和小脑颗粒神经元,以期发现与PrPAP有理想阳性结合的细胞作为进一步受体分离材料。(2)构建融合蛋白 PrPFC,获得稳定转染并表达蛋白的细胞,大量收集培养液,以蛋白A琼脂糖柱纯化PrPFc。快速冷冻处理组织,冰冻切片,以PrPFc与小鼠脑切片孵育,以抗什为第一抗体,继以传统免疫组织化学方法显示配体、受体结合部位。(3)提取生后 14天的野生型动物和 Prnp基因敲除小鼠的 mRNA与小鼠的基因库杂交进行DNA芯片分析。(4)以生化方法分离和鉴定细胞型脆蛋白的受体。方法以亲和层析和免疫沉淀为原理,以一个带有三个功能基团的交联剂连接配体和受体,以 strepta。,idin砰 protein A-磁珠为结合反应载体,从小鼠成年全脑匀浆作为结合起始材料,以蔗糖密度梯度离心法进 4行细胞亚组分分离,以 SDS-PAGE显示阳性结合条带,以 Western blot确定蛋白身份。 结果和结论:门)瞬时表达克隆未鉴定出阳性结合分子;所检测的粘附分子中仅N-CAM有与PrPAP的类似阳性结合;雪旺氏和少突胶质细胞系有P:P的阳性结合细胞,阳性率不高:小脑颗粒细胞以理想的阳性结合成为待选受体分离材料。(2)结合蛋白在成年鼠脑内分布广泛:大脑皮层和壳核有最丰富结合蛋白含量,丘脑和下丘脑及脑干含量中等,海马的CA区和齿状口以及小脑的蒲肯野和颗粒细胞层阳性细胞有集中分布。嗅球和脊髓也有一些阳性细胞:在14天的鼠脑中,结合蛋白的分布和染色强度都和成年组相似,而出生当日和7天组动物脑中,结合蛋白也与以上组有相似脑区分布但阳性细胞明显较少:在所有发育阶段,结合蛋白分布在野生型和基因敲除型动物中无明显区别。()编码Bas…n和Preb1山n的基因在尸rop基因敲除小鼠中水平下调。H )初步鉴定膜蛋白 N4 K-ATPase aZ subunit,Basigin,Caspr和 N-CAM为 PrPc的膜上结合蛋白。测序结果所得的一些细胞骨架蛋白 neurofilament triPletp protein,neurofilament-L,alpha-Intemexln和 gamma actin,PrPc更可能与之作用维持细胞骨架的稳定性。 新发现、新观点、新创造:首先,目前发现的所有肮蛋白的结合分于山于获取方法所限尚未有证据表明其直接结合,而且对结合功能也多为推测,本研究的立意在于从功能着手,分离和鉴定肮蛋白受体,并进一步鉴定其生理功能。其次,以配体与脑片直接孵育定位受体在小鼠脑内的定位研究是在抗原抗体的免疫组织化学反应基础上的延伸,在方法和结果上都尚未有报道。并且经过对脑片不同处理方法的探索,找 5到了可行的定位受体的方法。再次,在受体的鉴别和分离中,改进传统的亲和层析方法,以多功能交联剂连接配体和受体,并分别以Stre