论文部分内容阅读
本实验室前期针对NK蛋白质的结构特点和特殊的理化性质,克隆了NK的全长基因,构建了大肠杆菌/枯草杆菌穿梭表达质粒,实现了在枯草杆菌中的高效表达,开发研制了基因重组表达的纳豆激酶蛋白。作为具有活性的生物大分子药物,纳豆激酶直接口服生物利用度不高。纳豆激酶在pH6～12、50℃以下时均较稳定;具有抗胃蛋白酶及胰蛋白酶性能,但对酸性环境敏感;因此要提高纳豆激酶口服后的生物利用度,最重要的是防止胃酸环境的破坏,促进纳豆激酶在十二指肠后段肠腔中的吸收。本课题利用超临界CO2流体技术以pH敏感的肠溶材料Eudragit（?） L100-55对纳豆激酶的载药微丸进行包衣。主要研究:1.优化纳豆激酶的摇瓶发酵表达及纯化;2.建立以超临界CO2流体技术制备纳豆激酶肠溶微丸的工艺;3.模拟胃肠环境下评价微丸中药物活性、含量的方法;4.对纳豆激酶特殊口服制剂进行初步的药理学、药效学研究。我们选择超临界CO2流体作为反应体系,在乙醇作为助溶剂,增塑剂柠檬酸三乙酯和抗粘剂滑石粉存在的条件下,以pH敏感的肠溶材料Eudragit（?）L100-55对纳豆激酶的载药微丸进行包衣。在制备工艺研究中,根据预实验,包衣工艺受多种因素影响,主要有温度、压力、包衣材料和载药微丸比例、搅拌棒转速、助溶剂乙醇、抗粘剂滑石粉和增塑剂柠檬酸三乙酯的用量和配比以及反应时间等。为保证试验精度,对一些影响因素较小、易确立的实验条件,如反应温度、搅拌棒转速、增塑剂柠檬酸三乙酯的应用等采用单因素法确定,对影响因素较大的处方工艺条件如反应压力、包衣材料和载药微丸比例、助溶剂乙醇和抗粘剂滑石粉的配比4个可变因素进行正交设计,确定最佳条件,考察指标为微丸的平均粒径。结果显示最适反应条件为:包衣材料和载药微丸质量比为1:2,反应压力和温度分别为20MPa、35℃,增塑剂柠檬酸三乙酯及助溶剂乙醇均为10%（v/m）,抗粘剂滑石粉虽对包衣反应稍有影响,但能显著改善微丸粘连问题。体外实验结果表明肠溶微丸在人工胃酸（pH1.2）环境中2h仅释放9.7%,并能保持近90%的活性状态;在pH6.8的模拟肠液释放介质中2h内快速释放达75%。以超临界CO2流体技术制备的纳豆激酶口服肠溶包衣微丸,在人工胃酸环境中几乎不释药,可避免胃酸环境对纳豆激酶活性的破坏;在pH6.8的类肠液环境中药物释放快速而完全,有利于纳豆激酶在肠道中的吸收。以大鼠和大白兔对纳豆激酶特殊口服制剂做初步的药理、药效学研究,经口腔灌胃纳豆激酶特殊肠溶制剂后,考察对APTT、PT、TT、FIB和FDP指标的影响。结果显示口服大剂量纳豆激酶制剂后,两种动物PT值均明显延长,Fib含量降低。显示肠溶制剂显著提高了纳豆激酶的口服生物利用度,表现出了明显的生物学指标变化。