米糠蛋白(Rice bran protein,RBP)是一种具有高营养价值的优越蛋白,且2018年我国米糠的年产量达14.13千万吨,RBP来源巨大并具有很大的研究价值和开发潜力。但就目前的状况来看,RBP不仅存在难提取的问题,而且在提取过程中往往成品颜色较深,很大程度的限制了它的商业价值。褐变反应往往是有色物质产生的主要来源,褐变反应主要包括酶促褐变与非酶促褐变两种形式。目前大部分关于RBP褐变的相关研究着力于酶促褐变,而有关RBP非酶促褐变的研究仅集中于抑制剂的选择,由还原糖引起的RBP非酶促褐变的反应机理尚未明确。RBP由四种分级蛋白组成,分级蛋白的基本信息与表达决定着RBP的生命活动,探究分级蛋白的颜色及糖基化修饰情况对进一步明确蛋白产品的非酶促褐变具有重要意义。因此,本实验以新鲜米糠为原料,石油醚脱脂后采用超声辅助碱法进行提取,观察蛋白的颜色变化,并进一步提取分级蛋白,观察分级蛋白的褐变情况并进行糖基化分析,以探讨分级蛋白上糖基化修饰及颜色变化与蛋白产品褐变的关系。采用单因素法及响应面优化对RBP提取的工艺参数进行确定,比较分析超声时间、超声功率、料液比对RBP提取率的影响,单因素实验结果表明在超声功率为120W、超声时间为30min,料液比为1:9时可达到最高的提取率;并进一步利用响应面优化提取条件,可得超声辅助碱提RBP的最佳工艺参数为:超声功率116.91W,料液比1:9.33、超声时间28.99min。实际操作过程中对此工艺进行了修正:超声功率设置为120 W,料液比1:9,超声作用30min。此时的蛋白提取率可达71.3%,与预测值非常接近。提取的RBP经冷冻干燥后发现蛋白颜色较深,经不同温度烘干得到的RBP颜色更深且差异很大:80℃、90℃烘干的蛋白的颜色显著深于50℃、60℃、70℃。采用Osborne分级法依次提取四种分级蛋白,对分级蛋白进行基本成分的比较分析。分级蛋白经冷冻干燥后比较其颜色发现,清蛋白与谷蛋白明亮度较低,呈现棕褐色,显著深于球蛋白与醇溶蛋白的颜色;四种分级蛋白经脱色后红褐色与黄色程度均有显著的下降,但清蛋白与谷蛋白的色泽仍显著深于球蛋白与醇溶蛋白。分级蛋白的红外色谱结果可见糖类与蛋白结合的官能团,可推断糖基化修饰的发生。对分级蛋白进行过碘酸雪夫染色发现,分级蛋白在10.77KDa处有紫红色区域的存在,可见分级蛋白中有糖基化修饰的现象。分别对四种分级蛋白10.77KDa处条带进行蛋白和糖类的质谱鉴定,蛋白鉴定结果可见四种蛋白主要组成存在不同:清蛋白中主要含有63KDa的球蛋白、新型蛋白酶、葡萄糖和核糖醇脱氢酶、1-半胱氨酸过氧化物还原酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、核苷二磷酸激酶、分子量为H4的组蛋白、α-淀粉酶、胰蛋白酶抑制剂、RA5种子过敏蛋白、RA5B过敏原等蛋白;球蛋白主要由63KDa的球蛋白、新型蛋白酶、Os08g0127900蛋白、Os03g0197300蛋白、α-淀粉酶、16kDa油质蛋白、Os06g0221300蛋白、Os03g0277500蛋白、H4组蛋白、RA5种子过敏蛋白、RA5B过敏原、胰蛋白酶抑制剂、非特异性脂质转移蛋白片段、17D醇溶蛋白以及Os08g0180500蛋白、OSJNBa0041A02.15蛋白、Os03g0747600蛋白组成;醇溶蛋白中含有Os05g0331800蛋白、17D醇溶蛋白、Os05g0329400蛋白、Os05g0328800蛋白、Os05g0328632蛋白、13 kDa醇溶蛋白、18kDa油质蛋白、RA5种子过敏蛋白、RA5B过敏原、8-2类胚芽蛋白、α-淀粉酶、Os10g0558400蛋白与Os04g0617500蛋白;谷蛋白中主要包括A1型谷蛋白、A2型谷蛋白、A3型谷蛋白、新型蛋白酶、63KDa的球蛋白、B5型谷蛋白、17D醇溶蛋白、B1型谷蛋白、B2型谷蛋白、Os05g0328632蛋白、Os05g0331800蛋白、16kDa油质蛋白、Os03g0197300蛋白、Os02g0249000型谷蛋白、O502g0453600型谷蛋白、13 kDa醇溶蛋白、RA5种子过敏蛋白、RA5B过敏原、BAG结构域蛋白、Os06g0728600蛋白、EF手型家族蛋白。糖类质谱分析结果可见:清蛋白中有己糖修饰的存在;球蛋白中发现岩藻糖修饰的情况;醇溶蛋白中存在己糖、庚糖的修饰;谷蛋白中具有糖基化修饰的蛋白最多,可见己糖、庚糖、岩藻糖等糖基化修饰的发生。综上所述,分级蛋白中存在糖基化现象,且根据分级蛋白之间的颜色差异推测清蛋白与谷蛋白中某些蛋白片段的糖基化现象与蛋白的褐变现象存在关联。为了 RBP在食品工业中更好的利用,采用超声辅助碱法优化RBP的提取并针对蛋白褐变这一现象对分级蛋白的性质进行研究,阐述了分级蛋白提取及颜色变化并进一步做糖基化分析,为RBP及其分级蛋白的加工利用提供一定的理论依据,并为谷物蛋白的研究提供参考。