肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种具有多向效应的细胞因子,在细胞的增殖、分化、死亡以及炎症发生和自身免疫疾病中发挥了重要作用。哺乳动物中的研究表明,TNF-α生理功能的发挥主要由其两个特异性膜上受体TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)和TNFR2所介导。目前,TNF-α在多种硬骨鱼中已经被分离克隆,其免疫调节功能也被相继鉴定,但在硬骨鱼中其受体TNFR1和TNFR2的相关信息却很少,关于鱼类TNFR1和TNFR2在炎症反应中的地位、功能差异、是否存在可溶性形式以及可溶性受体在鱼类免疫中的作用均有待系统研究。本论文以草鱼(grass carp)为研究模型,比较分析了草鱼TNFR1(gcTNFR1)和gcTNFR2的表达特征,鉴定了它们介导草鱼TNF-α信号的功能地位,明确了草鱼可溶性TNFR1和TNFR2的存在,特别揭示了受体胞外区蛋白的抑炎症作用。具体研究内容包括以下方面:1、草鱼TNFR1和TNFR2的克隆鉴定、组织表达谱分析。(1)采用分子克隆技术获得gcTNFR1和gcTNFR2的全长cDNA序列,生物信息学方法分析gcTNFR1和gcTNFR2的序列信息、与各自的同源分子的亲缘关系,预测它们的基因结构和蛋白结构。(2)荧光定量PCR方法检测gcTNFR1和gcTNFR2基因在健康草鱼中的组织分布情况,发现两个受体在所检测的组织中都有表达,但是除了脾脏之外gcTNFR1的转录水平显著高于gcTNFR2,表明两者存在表达差异。2、在炎症条件下草鱼TNFR1和TNFR2的表达特征分析。(1)在重组草鱼TNF-α(rgcTNF-α)和细菌脂多糖(LPS)刺激草鱼头肾白细胞(HKLs)的体外实验中,发现rgcTNF-α能迅速上调gcTNFR2的基因表达而对gcTNFR1仅有微弱的上调作用,LPS则需较长时间作用才能上调两个受体的基因表达。(2)在嗜水气单胞菌感染草鱼的体内实验中,发现gcTNFR1和gcTNFR2的mRNA表达在鳃、肝和头肾中都能被上调。此外,gcTNFR1还能在肠中被上调表达,并且随着时间的延长恢复到静息水平。体外实验和体内实验说明在炎症条件下gcTNFR1和gcTNFR2基因都能被诱导表达,并且表达谱有所异同。(3)根据gcTNFR1和gcTNFR2氨基酸残基序列信息,制备了gcTNFR1和gcTNFR2的多克隆抗体,并验证了它们的特异性。分别利用两个抗体进行免疫组化分析,结果显示:经嗜水气单胞菌感染后,gcTNFR1在肠、中肾和脾中的表达显著增加;gcTNFR2的表达量在中肾和脾中也有增加但在肠中有所下降,揭示gcTNFR1和gcTNFR2介导TNF-α信号具有组织和时间差异性。3、草鱼TNFR1和TNFR2的功能鉴定。(1)相关质粒构建:从草鱼基因组中分离得到IL-1b的启动子序列并构建荧光素酶报告质粒;分别构建gcTNFR1和gcTNFR2的真核表达质粒。(2)在过表达gcTNFR1或gcTNFR2的COS7细胞中,通过荧光素酶报告系统发现rgcTNF-α分别通过两个受体调控NF-kB活性和IL-1b的启动子活性,证明两个受体都参与介导TNF-α诱导的NF-kB信号激活和IL-1b的转录。(3)在证明rgcTNF-α能诱导细胞凋亡的基础上,发现gcTNFR1和gcTNFR2过表达都放大了rgcTNF-α对细胞凋亡的影响,证明gcTNFR1和gcTNFR2都参与介导rgcTNF-α诱导的细胞凋亡。(4)利用gcTNFR1和gcTNFR2特异抗体进行免疫中和实验,发现中和gcTNFR1后能显著抑制rgcTNF-α诱导的IL-1b的分泌,而中和gcTNFR2后没有类似的效果,表明是gcTNFR1而非gcTNFR2参与调控TNF-α诱导的IL-1b蛋白分泌。4、草鱼TNFR1和TNFR2可溶性形式的鉴定与胞外区蛋白的重组表达及功能分析。(1)在草鱼HKLs细胞培养液上清中使用两个受体的抗体能检测到可溶性TNFR1和TNFR2的存在,并且嗜水气单胞菌感染能显著上调两个可溶性受体的量。(2)采用原核表达系统及亲和层析方法获得了高纯度草鱼TNFR1和TNFR2胞外区重组蛋白(rgcTNFR1和rgcTNFR2)。(3)通过基于ELISA的TNF-α体外结合实验,发现rgcTNFR1和rgcTNFR2都能与rgcTNF-α在体外结合,并且rgcTNFR2的结合能力明显强于rgcTNFR1。(4)rgcTNFR1和rgcTNFR2与rgcTNF-α共同处理草鱼HKLs,发现它们均能拮抗rgcTNF-α对gcIL-1b基因表达的上调作用。(5)采用竞争性ELISA发现rgcTNFR1和rgcTNFR2都能抑制rgcTNF-α诱导的IL-10分泌。上述结果从基因转录和蛋白分泌水平证明rgcTNFR1和rgcTNFR2具有拮抗TNF-α活性的功能。5、rgcTNFR1和rgcTNFR2的抗细菌感染作用。(1)致病性嗜水气单胞菌感染草鱼后腹腔注射rgcTNFR1,发现rgcTNFR1能在草鱼感染细菌的后期抑制嗜水气单胞菌引起的TNF-α基因的上调表达和改善血清生化指标,说明rgcTNFR1可能发挥抵抗炎症的作用。(2)rgcTNFR2腹腔注射感染嗜水气单胞菌的草鱼后,不同组织的HE染色结果表明rgcTNFR2能在头肾、肠、肝脏和脾脏中有效缓解嗜水气单胞菌引起的出血、炎性细胞浸润等病理损伤,显著减轻细菌引起的脾肿大。这些结果表明rgcTNFR1和rgcTNFR2可以作为草鱼炎症控制的潜在药物。综上所述,本论文分离鉴定了gcTNFR1和gcTNFR2基因,分析了其基因结构和蛋白结构的异同、组织表达谱差异及其在炎症条件下的不同诱导表达模式;分别从基因转录水平、蛋白分泌水平和细胞水平探讨了gcTNFR1和gcTNFR2介导TNF-α诱导的炎症反应和细胞凋亡的联系与差异;确定了草鱼可溶性TNFR1和TNFR2的存在,并通过制备的两个受体胞外区重组蛋白模拟可溶性受体,证明它们在体外能与rgcTNF-α结合,并在TNF-α诱导的炎症反应中具有拮抗作用;进一步探索了两个受体胞外区重组蛋白在保护草鱼抵抗细菌感染方面的作用。本论文的结果揭示了硬骨鱼TNFR1和TNFR2的诱导表达谱和在介导TNF-α信号转导过程中的功能地位以及两个受体胞外区重组蛋白的潜在治疗作用,不仅提供了鱼类TNFR1和TNFR2特有的表达特征和功能进化信息,丰富了基于TNF-α信号的鱼类免疫调节机制的内容,而且发现了天然存在的可溶性受体,提供了鱼病治疗的潜在药物。