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背景:众所周知,血小板源性生长因子(PDGF)可以诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转换,即从收缩型转换为合成型,而表型转换又是VSMCs增殖的基础。我们的前期研究证实了PDGF在VSMCs中可以上调Shh信号表达,同时抑制Shh信号可以阻止PDGF引起的VSMCs增殖。此外,大量研究提出KLF4作为重要的转录因子参与了PDGF诱导VSMCs表型转换的过程,而我们的前期研究发现KLF4在Shh功能发挥中起到重要的作用。这也促使我们推测Shh可能参与了PDGF诱导的VSMCs表型转换,而KLF4可能参与了此过程。目的:在本研究中,我们主要调查Shh信号是否参与PDGF诱导的VSMCs表型转换。其后的机制研究中,我们进一步探讨Shh信号是否通过KLF4调控PDGF诱导的VSMCs表型转换。本研究将是我们前期实验结果的重要补充和完善,同时为VSMCs增殖所导致的疾病提供新的治疗思路。方法:(1)首先,我们利用血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)刺激VSMCs,通过Western blot及RT-PCR检测Shh信号通路及KLF4表达情况。然后给予伊马替尼(Imatinib)抑制PDGF受体β(PDGFRβ),给予MEK抑制剂PD98059抑制ERK1/2信号,其后观察Shh信号通路表达情况,评估PDGFRβ及ERK1/2信号在PDGF诱导的Shh信号表达中的作用。(2)然后,利用VSMCs分化型标志物α-actin和myocardin,VSMCs去分化型标志物去分化型标志物Tpm 4和SMemb来评估VSMCs的表型状态,观察PDGF诱导的VSMCs表型转换过程中Shh及KLF4信号表达情况。利用Shh-si RNA或Smoothened抑制剂cyclopamine抑制Shh信号通路,利用Shh-c DNA或重组N-Shh过表达Shh信号通路,评估Shh信号在PDGF诱导的VSMCs表型转换中的作用,以及单独的Shh信号是否具备促进VSMCs表型转换的潜能。(3)最后,利用KLF4-si RNA抑制KLF4信号,并利用N-Shh或PDGF-BB诱导VSMCs去分化,观察KLF4在PDGF或Shh诱导的VSMCs表型转换中的作用。结果:我们发现PDGF通过活化PDGFRβ/ERK1/2通路促进VSMCs Shh信号通路激活。其后我们观察到PDGF促进VSMCs表型转换过程中伴随Shh/Gli2信号及KLF4活化。在给予PDGF刺激同时抑制Shh信号通路,发现VSMCs去分化标志物Tpm 4和SMemb及KLF4信号表达下降,提示PDGF诱导VSMCs表型转换及KLF4表达作用消失。然后在无PDGF刺激下过表达Shh信号,发现单独的Shh信号可以刺激KLF4表达同时促进VSMCs去分化。最后,我们发现抑制KLF4后,PDGF及Shh信号诱导的VSMCs表型转换作用均消失。结论:本研究证实了PDGF可诱导VSMCs中Shh信号通路及KLF4激活;Shh及KLF4参与PDGF诱导的VSMCs表型转换;PDGF通过Shh信号促进VSMCs的去分化;而PDGF及Shh信号调控VSMCs表型转换又是通过活化KLF4实现的。综上所述,我们的研究提供了关于Shh在VSMCs增殖发病机制中全新的见解,也就是Shh可以通过KLF4调控PDGF诱导的VSMCs表型转换。背景:肢体缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)是临床常见疾病。骨骼肌因其较高的代谢活性,在缺血血流恢复后极易发生I/R损伤。尽管严重缺血后血流恢复,骨骼肌损伤持续存在,后续可发生骨骼肌坏死,导致患者截肢,甚至多器官功能障碍。Shh在胚胎后时期对骨骼肌损伤及修复发挥了重要作用,同时大量研究也证实了Shh在骨骼肌缺血中发挥了保护作用。然而,目前国内尚无关于Shh在骨骼肌I/R损伤中的作用及机制研究。目的:本研究通过建立止血带小鼠后肢I/R损伤模型,评估Shh信号通路在骨骼肌I/R损伤中发挥的作用。为寻找其中的机制,我们将研究Shh是否通过经典合成代谢通路AKT/m TOR/p70S6K发挥骨骼肌I/R损伤的保护作用。最后,我们将探讨Shh信号对骨骼肌I/R损伤中相关的骨骼肌凋亡的影响。我们希望通过这些研究为骨骼肌I/R损伤提供新的治疗策略。方法:(1)选取10-14周雄性C57BL/6小鼠,利用止血带建立小鼠后肢I/R损伤模型,即单侧后肢缺血3 h,其后松开止血带恢复血流灌注1 d,3 d,5 d,7 d及14 d,并于不同时间点获取骨骼肌标本。利用Western blot法检测Shh信号通路相关蛋白包括Shh,Gli1及Gli2表达情况。同时,利用免疫荧光法检测骨骼肌组织Shh信号表达。(2)为了阐明Shh信号是否参与了骨骼肌I/R损伤的调控。通过腹腔注射Smoothened直接抑制剂Cyclopamine以抑制Shh信号通路。相反,通过损伤侧后肢肌肉注射质粒编码人Shh基因(ph Shh)以过表达Shh通路。建立模型并取I/R 7 d损伤小鼠骨骼肌标本,通过Western Blot法或者免疫荧光检测法评估抑制及过表达Shh信号效率。其后通过H&E染色骨骼肌损伤评分评估骨骼肌损伤程度,通过Masson染色评估骨骼肌纤维化程度。(3)为了研究AKT/m TOR/p70S6K信号通路在骨骼肌I/R损伤中时间-表达进程,利用Western blot检测不同灌注时间AKT,m TOR,p70S6K以及他们的磷酸化蛋白表达水平。为进一步验证AKT/m TOR/p70S6K信号通路是否参与了Shh诱导的I/R损伤保护,利用肌肉注射ph Shh方式过表达Shh信号,并在I/R 7 d损伤时间点检测AKT/m TOR/p70S6K信号通路表达。其后为进一步研究其中机制,利用ph Shh过表达Shh的同时,通过腹腔内注射PI3K-m TOR双向抑制剂NVP-BEZ235抑制AKT/m TOR/p70S6K信号通路,并在I/R 7 d损伤时间点检测AKT/m TOR/p70S6K信号通路表达、骨骼肌损伤评分及骨骼肌纤维化。(4)本研究中,我们还将评估I/R损伤所致的骨骼肌凋亡。首先,利用Western blot检测法评估凋亡蛋白Cleaved Caspase 3及Bax,抗凋亡蛋白Bcl2的时间-表达进程。其后为进一步研究Shh在骨骼肌I/R损伤中的作用,过表达Shh信号并在I/R 7 d损伤时间点检测凋亡蛋白Cleaved Caspase 3及Bax,抗凋亡蛋白Bcl2表达,同时还利用TUNEL染色评估骨骼肌凋亡水平。结果:(1)首先,我们发现I/R损伤可导致Shh,Gli1及Gli2表达升高,并在再灌注5 d达到峰值,其后表达量逐渐下降。免疫荧光检测提示在正常组及I/R 1 d组,几乎不能检测到Shh信号表达。在I/R 3d,5 d组,于骨骼肌基底膜可以观察到明显的Shh信号表达,该信号表达靠近于骨骼肌肌核或者与骨骼肌肌核共定位。在I/R 7 d组和I/R 14d组,Shh信号表达减弱。(2)在进一步研究中发现,Shh信号通路抑制剂Cyclopamine治疗骨骼肌局部可见坏死区域,同时H&E染色骨骼肌损伤评分评估增高(P<0.05),提示抑制Shh信号通路后骨骼肌I/R损伤加重。同时Masson三色染色提示Cyclopamine治疗组可以观察到明显增多的胶原堆积(P<0.05)。并且,当利用肌肉内注射ph Shh过表达Shh信号通路时,可以观察到相反的结果。(3)然后,Western blot结果提示骨骼肌I/R损伤后早期Shh信号表达升高同时伴随AKT,m TOR及p70S6K信号磷酸化水平升高,其后均逐渐降低。ph Shh治疗可导致p-AKT/AKT,p-m TOR/m TOR及p-p70S6K/p70S6K比值明显升高,而这种作用又可被NVP-BEZ235治疗所阻断。(4)最后,Western blot检测提示凋亡蛋白Cleaved Caspase 3水平及Bax/Bcl2比值在I/R损伤后逐渐升高,均在I/R 7 d达到峰值,其后开始下降。而进一步探讨Shh对凋亡通路影响时发现过表达Shh信号可降低I/R 7 d凋亡蛋白Cleaved Caspase 3表达,及Bax/Bcl2比值(P<0.05)。而TUNEL染色评估提示外源性ph Shh治疗可降低I/R损伤后骨骼肌凋亡指数(P<0.05)。结论:Shh信号在胚胎后时期小鼠后肢骨骼肌I/R损伤模型中可被再激活;Shh信号在小鼠后肢骨骼肌I/R损伤中通过AKT/m TOR/p70S6K信号通路发挥抗骨骼肌损伤及抗骨骼肌纤维化作用;同时,Shh信号在小鼠后肢骨骼肌I/R损伤中发挥抗凋亡作用。