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马氏珠母贝(Pinctada martensii),因盛产优质珍珠而闻名于世,是中国南方沿海地区培育珍珠的主要贝类。珍珠主要通过外套膜包裹珠核进行人工“插核手术”后培育,整个过程会伴随着贝体的炎症及免疫反应。因此,珍珠贝的外套膜在珍珠形成中起着重要的作用。目前,珍珠贝在采珠后的贝肉多被废弃,其外套膜主要营养成分是蛋白质,所以,充分开发利用外套膜的功能价值是非常必要的。本文采用酶法制备马氏珠母贝外套膜酶解产物,通过体外、体内实验进行皮肤创伤愈合功能作用的研究,为进行深入研究提供理论基础和方向。本研究主要内容和结果如下:(1)通过酶法制备马氏珠母贝外套膜酶解物(EHMPM),建立小鼠皮肤全皮层创伤模型,以涂抹和灌胃给药两种方式评价其促愈合活性。EHMPM蛋白质含量为55.66 g/100g,其中,肽含量占蛋白含量的21.56%;必需氨基酸占总氨基酸的63.02%;支链氨基酸分别占总氨基酸的32.92%;疏水性氨基酸占总氨基酸的59.75%。与阴性对照组相比,涂抹给药EHMPM能显著缩短止血时间,无毒性;两种方式给药EHMPM均显著缩短上皮化时间,提高伤口愈合率。第7天,与两个对照组相比,涂抹给药组能够抑制炎症因子IL-6生成;与阴性对照组相比,各给药组均能够显著促进IL-10分泌;并且,与阴性对照组相比,涂抹给药组能促进TGF-β和CCND1分泌;灌胃给药三个剂量组的TGF-β,中、高剂量组的CCND1和低、高剂量组的EGF含量均显著增加。第14天,灌胃给药三个剂量组均能显著提高皮肤组织中的羟脯氨酸含量;并且,涂抹和灌胃给药低、高剂量组可显著抑制瘢痕残留。结果表明,涂抹、灌胃给药EHMPM均具有通过抑制炎症反应、促进生长因子调节细胞增殖,促进胶原蛋白形成以加快小鼠皮肤创伤愈合的作用。因此,本研究继续采用涂抹和灌胃给药的方式、根据皮肤创伤愈合阶段选择生物指标(炎症因子、生长因子等)及检测技术开展更深入的研究。(2)EHMPM依次经过陶瓷膜、超滤系统初步分离获得>5 KDa、3-5 KDa和<3 KDa组分(蛋白质含量分别为71.75、62.85、54.69%;肽含量分别为64.10、78.92、50.40%),通过体外实验,测定各超滤组分止血和抗菌活性;建立小鼠皮肤全皮层创伤模型,采用ELISA、H&E染色、免疫组化学染色等技术检测细胞因子及相关蛋白的表达、胶原蛋白形成评价其促愈合活性及其相关作用机制。结果显示,<3 KDa超滤组分具有一定的促凝血作用;涂抹、灌胃给药EHMPM超滤组分在止血、脱痂、上皮化时间、伤口愈合率、抗炎、血管生成、上皮化、成纤维分化、促进胶原的生成和重塑、抑制瘢痕形成等各方面均显著优于阴性对照组。其中,涂抹和灌胃给药<3 KDa组分均具有显著促进伤口愈合和抑制瘢痕形成的作用,这与其能显著缩短止血及上皮化时间、并通过在炎症期分泌抗炎因子IL-10抑制炎症反应,促进CD31、FGF和EGF表达,以及TGF-β1分泌,从而有效加快伤口的上皮化和收缩,促进胶原蛋白沉积并抑制浅表疤痕增生有密切关联。<3 KDa超滤组分是促进小鼠皮肤创伤愈合的最佳活性组分。因此,本研究对<3 KDa超滤组分进行分离纯化,通过细胞实验开展作用机制的初步探讨。(3)通过对<3 KDa超滤组分进行理化分析和质谱分析后,采用凝胶色谱法(Sephadex G25)对组分进行分离,得到F1、F2、F3和F4四个组分,选择Ha Ca T和HSF细胞开展增殖实验评价<3 KDa超滤组分及4个纯化组分的增殖活性。结果表明,<3 KDa超滤组分由分子量范围为302.17-2936.43 Da的多肽组成,含有2-15个氨基酸的多肽含量占73.87%,疏水性氨基酸占56.51%,并含有Gln-Leu和AspLeu的两个特征肽片段。<3 KDa超滤组分和F4组分均具有促进Ha Ca T和HSF增殖活性,其中,F4组分是最佳组分,最佳浓度为12.5μg/m L。这与动物实验研究成果相符,丰富了马氏珠母贝外套膜活性肽的促愈作用机理。(4)本研究以马氏珠母贝外套膜<3 KDa超滤组分为核心促愈活性成分,初步研制具有海洋特色的天然促愈软膏,建立小鼠皮肤全皮层创伤模型,以涂抹给药方式评价其促愈合活性。与阴性对照组相比,该软膏通过缩短上皮化时间(10.80±1.10天),提高伤口愈合率,抑制炎症反应,促进成纤维细胞分化和肉芽组织的形成,并通过TGF-β/Smad信号通路影响胶原合成,促进CCND1分泌及CD31、EGF和FGF增殖,从而抑制瘢痕生成,提高了伤口愈合的速度和质量。