腹泻是导致断奶仔猪死亡的重要传染性疾病,对养猪业造成了巨大的经济损失,F18大肠杆菌（E.coliF18）菌株是引起断奶仔猪细菌性腹泻的主要病原菌之一。为了进一步揭示中国地方猪品种断奶仔猪抗E.coli F18的遗传基础和调控机制,本研究以地方品种—梅山猪为研究对象,利用不同血清型F18大肠杆菌F18ab和F18ac菌株口服攻毒试验,并结合仔猪肠道E.coliF18细菌检测、细菌计数以及小肠上皮细胞黏附等一系列试验验证,筛选出确证的梅山猪F18大肠杆菌抗性与敏感型断奶仔猪个体,进一步利用RNA-seq转录组和长链非编码RNA（lncRNA）测序对梅山猪F18大肠杆菌抗性相关调控通路、功能基因以及lncRNA进行了系统筛选,并从mRNA、蛋白质以及细胞水平分别对重要调控通路、关键基因以及lncRNA进行系统的功能验证,以期揭示功能基因及lncRNA在梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性过程中的调控作用及其分子机制,为解决国内地方猪种E.coli F18抗性育种关键科学问题提供一定的理论参考。此外,本研究同时以培育品种—苏太猪（杜洛克X梅山猪）为研究对象,基于课题组前期建立的苏太猪F18大肠杆菌抗性与敏感型资源群体,利用高通量测序分析了苏太猪F18大肠杆菌抗性相关的调控通路以及候选基因,结合关于外来猪品种F18大肠杆菌抗性基因的文献挖掘结果,进一步探讨和验证外来猪品种F18大肠杆菌抗性相关的调控通路以及候选基因,以期揭示中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控遗传基础的差异性。主要研究结果如下:1.梅山断奶仔猪E..coli F18敏感和抗性型个体间十二指肠转录组分析（1）梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性与敏感型个体间筛选出198个差异表达基因DGEs,其中抗性组上调基因125个,大部分DGEs涉及到免疫系统“Immune System”和感染性疾病“Infectious Diseases”通路,其中筛选出一个富集程度较高的免疫通路—Toll样受体信号通路（Toll-likereceptor signaling pathway）以及通路中关键的基因CD14。（2）脂多糖（LPS）诱导小肠上皮细胞IPEC-J2后,qPCR和western blot检测发现Toll样受体信号通路中大部分基因（CD14、TLR4、IL-1β、ERK、IFN-α、JNK、p38、NFkB和TNFF-α）表达水平均表现出明显的上调,表明Toll样受体信号通路在调控F18大肠杆菌感染过程中确实发挥重要的作用。（3）免疫组化IHC结果表明,CD14在肠道组织中广泛分布,并且抗性组中表达水平明显高于敏感组;利用RNAi沉默CD14基因后,F18ab菌毛与IPEC-J2黏附能力极显著上升（P<0.01）,而F18ac菌毛与IPEC-J2黏附能力上升但不显著（P>0.05）;通路中IL-1、IFN-α、TLR4和TNF-α基因表达水平均发生显著下调（P<0.05）,而MyD88基因表达水平下调但不显著（P>0.05）;白细胞介素（IL-6和IL-12）因子表达水平显著下降（P<0.05）,而IL-8、MIP-1α和MIP-1p表达量降低但未达到显著水平（P>0.05）。以上结果表明CD14表达水平上调有利于提高F18大肠杆菌抗性。2.苏太断奶仔猪五.coli F18敏感和抗性型个体间十二指肠转录组分析（1）苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性与敏感型个体间筛选出238个差异表达基因DGEs,其中抗性组上调基因112个,DGEs涉及到免疫相关通路如抗原加工与呈递（Antigen processing and presentation）、Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）,其中包括TAP2、TLR5、IL1β基因;以及鞘糖脂合成通路（Glycosphingolipidbiosynthesis-lacto andneolacto series）,其中包括具有重要生物学功能的FUT2基因。（2）LPS诱导以及不同血清型F18大肠杆菌F18ac、F18ab分别刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后,qPCR和Western blot检测FUT2、TAPP2、IL-1β和TLR5表达水平均表现为明显的上调;组织表达谱检测表明,FUT2基因在肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、淋巴结、胸腺、十二指肠和空肠等组织中均有表达,其中肠道组织尤其是十二指肠表达量相对较高,qPCR和western blot检测表明,敏感组个体十二指肠和空肠组织中FUT2基因表达水平均极显著高于抗性组（P<0.01）;利用RNAi沉默FUT2基因后,IPEC-J2细胞对大肠杆菌F18ab和F18ac的黏附能力均显著下降（P<0.05）,以上结果表明FUT2基因表达水平下调有利于提高F18大肠杆菌抗性。（3）FUT2启动子区甲基化分析表明,22个CpG位点存在不同程度的甲基化,mC-6和mC-22位点甲基化水平与mRNA表达存在显著负相关（P<0.05）,其中mC-22位于Sp1转录因子结合位点上;凝胶迁移EMSA试验表明,十二指肠组织中核蛋白与FUT2野生型非甲基化探针结合,加入Sp1抗体后,非甲基化野生型探针出现了超迁移（supershift）现象,表明核蛋白中Sp1转录因子可以特异性结合FUT2野生型非甲基化探针,以上结果表明,FUT2启动子区mC-22位点甲基化修饰抑制了 Sp1转录因子与启动子DNA结合,降低了FUT2基因表达水平,进而提升了 F18大肠杆菌抗性。3.梅山与苏太断奶仔猪E.coli F18敏感和抗性型个体间十二指肠长链非编码RNA分析（1）lncRNA测序结合生物信息学分析在梅山猪和苏太猪中共获得2056个候选lncRNA分子,根据p-value<0.05原则,梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体之间存在24个差异表达lncRNA,其中抗性组中上调21个;苏太猪存在23个差异表达lncRNA,其中抗性组中上调7个。基于cis和trans机制进行靶基因预测发现,cis机制预测出梅山猪所有差异表达lncRNA上下游共存在59个可能靶基因,而苏太猪所有差异表达lncRNA上下游存在67个可能靶基因;trans机制预测出梅山猪RNA-seq中存在517个基因与差异lncRNA存在显著的表达相关性,而苏太猪RNA-seq中存在96个基因与差异lncRNA存在显著的表达相关性。靶基因参与GO功能以及KEGG通路分析表明,靶基因涉及到信号传导通路（如 NF-kappaB signaling pathway）、免疫相关通路（如 Toll-like receptor signaling pathway）、疾病感染通路（如Salmonella infection）、糖脂类合成相关通路（如Glycosaminoglycanbiosynthesis-KS）等。（2）梅山猪与苏太猪抗性与敏感型个体十二指肠间存在3个共同差异表达lncRNA:TCONS₀183659、TCONS₀0352975、TCONS₀0053650;结合靶基因预测及其功能分析,筛选出一个与F18大肠杆菌抗性相关的重要lncRNA—TCONS₀0183659,其序列100 kb范围内发现一个可能靶基因FUT3。TCONS₀0183659位于猪2号染色体,长度为5831 bp,具有两个exon（5746 bp和85 bp）,是不连续的,属于基因间的lncRNA。（3）qPCR检测结果表明,TCONS₀0183659在梅山猪和苏太猪F18抗性组个体十二指肠组织中表达水平极显著高于敏感组个体（P<0.01）;荧光原位杂交技术FISH分析表明,TCONS₀0183659在细胞核和细胞质中均有分布;成功建立沉默TCONS₀0183659猪小肠上皮细胞IPEC-J2系,干扰效率达到69.58%;RNA pull down结合western blot验证表明,TCONS₀0183659 与 Histone H4 存在相互作用;TCONS₀0183659 干扰前后 IPEC-J2蛋白组学结合western blot验证分析表明,干扰TCONS₀0053650后Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表达升高。以上结果表明,TCONS₀0183659可能通过与组蛋白Histone H4结合,从而调控Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表达。结合前期国内外相关研究结果,本研究进一步揭示了中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控的遗传基础确实存在差异,Toll样受体信号通路及其CD14基因在梅山猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中发挥着免疫调控作用,其中CD14基因表达上调有利于提高仔猪对E.coli F18感染抗性;而鞘糖脂合成通路及其FUT2基因可能在外来猪品种F18大肠杆菌受体形成过程中起关键作用,其中FUT2基因表达下调有利于提高仔猪对E.colE.F18感染抗性。此外,本研究系统揭示了长链非编码RNA在断奶仔猪F18大肠杆菌抗性过程中的调控机制,筛选出1个关键lncRNA:TCONS₀0183659,并且推测该lncRNA可能通过与组蛋白Histone H4结合,从而调控Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表达,今后需要进一步验证TCONS₀0183659调控作用是否与Histone H4表观遗传修饰有关。