第一部分:GBS相关C.jejuni在昆明小鼠粪便及消化道组织中的分离目的:1研究吉兰-巴雷综合征(Guillain barre syndrome,GBS)相关空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)灌胃昆明小鼠后于其消化道组织及粪便中的分离情况;2初步探究不同灌胃浓度、灌胃次数、小鼠周龄及是否给予百日咳对C.jejuni在小鼠粪便中存留时间的影响,以及攻毒后不同时间点C.jejuni在小鼠消化道组织中的分布,为建立小鼠周围神经疾病模型积累数据。方法:在42℃微需氧(5%O2、85%N2、10%CO2)条件下复苏从GBS患者粪便中分离的C.jejuni作为攻毒菌株。使用3-4周龄昆明雄鼠进行灌胃攻毒,进行A、B、C、D共4组实验。A组为探讨非生物活性颗粒通过消化道时间,将4周龄昆明雄鼠分为3组,A1组7只,A2组8只,A3组2只,A1、A2组使用140%Ba SO4水混悬液0.5ml进行灌胃,A3组(对照组)使用布氏肉汤0.5ml灌胃,A1组小鼠于灌胃后分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12小时留取粪便样本,A2组于灌胃后分别于14、16、18、20、21、23、26小时留取粪便样本,对照组于上述时间点交替留取粪便样本。将粪便样本置于1.5ml EP管中,按灌胃后留取时间顺序摆放于10×10冻存盒内,于河北医科大学第二医院放射科使用X光数字摄影成像系统进行透射观察,确定粪便中含有Ba SO4的时间段,并根据此时间段估计从鼠粪便中分离空肠弯曲菌的时间。B组为探讨灌胃浓度对小鼠粪便C.jejuni存留时间的影响,确定最佳单次灌胃浓度,按不同灌胃菌液浓度将4周龄昆明雄鼠分为4组:B1组5只,给予104CFU/ml菌液攻毒,B2组5只,给予108CFU/ml菌液攻毒,B3组5只,给予1010CFU/ml菌液攻毒,B4组3只,给予布氏肉汤攻毒。每组均灌胃1次,每次0.5ml。灌胃后分别于5、10、24、30、48、272、96、168小时留取小鼠粪便并从中分离空肠弯曲菌,测定C.jejuni的存留时间。攻毒7天后解剖小鼠,取消化道组织观察有无大体病理改变。C组为探讨不同灌胃次数、小鼠周龄以及是否给予百日咳对小鼠粪便C.jejuni存留时间的影响,配制3×108CFU/ml的攻毒菌液,依照不同灌胃方案对鼠进行灌胃后,分别于灌胃后48、72、96、168小时获取粪便样本,从中分离空肠弯曲菌,观察其形态。末次灌胃7天后解剖小鼠,取消化道组织观察有无大体病理改变。将3-4周龄昆明雄鼠分为6组:C1组4周龄5只,共灌胃2次,每次0.5ml,在初次灌胃24小时后追加1次灌胃,以追加灌胃时间为初始时间点。C2组4周龄5只,首先给予百日咳毒素200ng/只腹腔注射,每日1次,共2次,于第3天进行灌胃(0.5ml),以灌胃时间为初始时间点。C3组使用3周龄昆明雄鼠5只,灌胃1次(0.5ml),以攻毒时间为初始时间点。C4组使用3周龄昆明雄鼠5只,方案同第1组。C5组使用3周龄昆明雄鼠5只,方案同第2组。C6组(对照组)4周龄3只,给予布氏肉汤0.5ml灌胃,以灌胃时间为初始时间点。D组为探讨C.jejuni灌胃后于昆明小鼠消化道组织的分布,将昆明雄鼠分为3组:D1组4只,给予3×108CFU/ml的菌悬液0.5ml灌胃48小时后无菌解剖小鼠。D2组4只,灌胃120小时后解剖。D3组(对照组)2只,给予布氏肉汤0.5ml灌胃,分别于灌胃后48小时、120小时解剖。无菌解剖小鼠后,每隔10-15cm取消化道组织1-1.5cm(胃1段、小肠4段、盲肠1段、大肠2段)于无菌生理盐水内梯度涮洗8-10次去除消化道内容物、并于匀浆器内充分研磨释放消化道组织中的C.jejuni后,从中定性分离空肠弯曲菌,验证是否发生了细菌的侵袭。B至D组实验过程中,均对小鼠是否出现腹泻、瘫痪等表现进行观察记录,应用布里斯托粪便评分对粪便性状进行评价。结果:本实验成功从-80℃冰箱中复苏GBS相关C.jejuni菌株,经鉴定其马尿酸水解实验阳性,革兰染色为G-弯曲状、海鸥状菌,多重PCR鉴定示C.jejuni特异的16S、map A片段呈阳性。A组实验显示,小鼠粪便中Ba SO4存留时间为2-23小时。B组实验显示,C.jejuni以104CFU/ml单次灌胃昆明小鼠时其粪便中存留时间是5-24小时。108CFU/ml单次灌胃时存留时间是5-30小时,1010CFU/ml单次灌胃时是5-30小时。对照组粪便中未分离出C.jejuni。C组实验显示,C1组、C3组及C5组观察到攻毒48小时后于粪便中分离出C.jejuni,C3组168小时后于粪便中分离出1株C.jejuni。其余实验组及对照组攻毒48小时后未从粪便中分离出C.jejuni。D组实验显示,D1组1只小鼠小肠、盲肠、大肠分离出C.jejuni,胃、小肠第二段样本未分离出C.jejuni。D1组其他小鼠、D2组及对照组全部动物消化道各节段均未分离出C.jejuni。各组小鼠消化道大体观察未发现明显水肿、出血粘膜溃疡等病理改变。对各组实验C.jejuni分离株进行革兰染色观察,大量细菌具有长度缩短趋势,个别C.jejuni弯曲程度增高,呈“C”型或“S型”细菌。B-D三组实验动物实验过程中均未出现腹泻、瘫痪、死亡等表现,粪便主要呈香肠型、蛇形、柔软块状,未观察到水样糊状及液体样粪便。结论:1河北医科大学动物中心清洁级昆明雄鼠粪便及消化道组织内无C.jejuni存在。2 C.jejuni单次灌胃昆明雄鼠,粪便中存留时间是5-30小时。连续灌胃2次、增加灌胃浓度、减小小鼠周龄可使部分小鼠粪便C.jejuni存留时间延长。给予百日咳毒素不能使粪便C.jejuni存留时间延长。3 GBS相关C.jejuni可侵入昆明雄鼠小肠、盲肠及结肠组织。4 GBS相关C.jejuni通过昆明雄鼠消化道后形态发生变化。第二部分:GBS相关C.jejuni联合百日咳毒素致昆明小鼠周围神经损伤模型的探索目的:观察GBS相关C.jejuni联合百日咳毒素(Pertussis toxin,PT)攻毒昆明雄鼠后动物运动能力、体重的动态变化过程,初步探索GBS相关C.jejuni口服攻毒联合百日咳毒素腹腔注射致昆明雄鼠周围神经损伤模型的建立。方法:在微需氧(42℃、5%O2、85%N2、10%CO2)条件下复苏从GBS患者粪便中分离的C.jejuni作为攻毒菌株。使用4周龄昆明雄鼠进行灌胃攻毒,依照攻毒方案不同共分为4组,标记为E1、E2、E3、E4组。E1组昆明雄鼠20只,给予PT腹腔注射(200ng/只次、共2次,分别于实验开始后第1日、第7日给予)、C.jejuni菌液系统灌胃(4周12次,分别于第1-3日,第8-10日、第15-17日及第22-24日给予,每次3×108CFU/ml,0.5ml);E2组昆明雄鼠20只,给予生理盐水腹腔注射(0.5ml/只次、共2次,分别于实验开始后第1日、第7日给予),C.jejuni菌液系统灌胃(同E1组);E3组昆明雄鼠12只,给予PT腹腔注射(同E1组),无菌布氏肉汤系统灌胃(4周12次,分别于第1-3日,第8-10日、第15-17日及第22-24日给予,每次0.5ml);E4组(对照组)昆明雄鼠12只,给予生理盐水腹腔注射(同E2组),布氏肉汤系统灌胃(同E3组)。使用随机数表法于每组中抽取6只观察体重变化及运动能力变化趋势。于首次灌胃前2日每隔1±1天称量小鼠体重,监测实验动物灌胃前后短期内体重变化趋势;于D5每隔7±2天对小鼠称重,监测灌胃后长期体重变化趋势,并使用转棒式疲劳仪监测小鼠的运动能力随时间变化(监测上限300秒)。观察记录全部小鼠灌胃后精神、饮食、活动状态,使用Weavers评分对小鼠肌力进行评价;使用布里斯托粪便评分对鼠便进行评价。分别于第14天、第28天、第42天、第56天解剖实验动物(每时间点分别解剖E1-E4组动物5、5、3、3只),其中第14天解剖实验动物仅于第1-3天、第8-10天经历6次灌胃。留取小鼠双侧坐骨神经、双侧臂丛神经保存于多聚甲醛及戊二醛固定液内以备进一步病理分析。结果:本实验成功从-80℃冰箱中复苏GBS相关C.jejuni菌株,经鉴定其马尿酸水解实验阳性,革兰染色为G-弯曲状杆菌。实验过程中所有小鼠Weavers评分0分,但第2日E2组一只小鼠出现精神萎靡,第5日E1组两只小鼠出现毛发略稀疏,第17日E1组一只小鼠出现精神萎靡,余小鼠活动性、进食水等未见明显异常。布里斯托粪便分型主要呈香肠型、蛇形、柔软块状,未观察到稀便或不成形便。成功于首次灌胃前2日、前1日、第1日、第3日、第5日监测小鼠短期体重变化,各组小鼠体重均呈非线性增长趋势,各时间点进行ANOVA分析及LSD检验两两比较显示,E1组小鼠体重于第1日、第5日低于其他三组(P<0.01)。成功于第5日、第13日、第22日、第25日、第31日、第38日、第47日、第54日监测小鼠长期体重变化,前4周小鼠体重呈非线性增长趋势,后4周体重呈波动变化趋势。各时间点各组体重进行ANOVA分析及LSD检验两两比较显示,E1组体重除第13日外均低于E4组体重,除第13日、第47日外均低于E3组体重;E2组体重于第22日、第47日、第54日低于E4组体重;E3组体重除第38日、第47日低于E4组体重,余各时间点等于E4组体重。成功于首次灌胃前2日、第5日、第13日、第22日、第25日、第31日、第38日、第47日、第54日监测小鼠转棒力竭时间变化趋势,使用Kruskal-Wallis检验以及Nemenyi检验对各时间点组间力竭时间进行比较,其中E1组力竭时间于第13日-第25日显著下降,第25日后回升至正常水平。余各组力竭时间随实验进程无明显增长或下降趋势,组间无显著性差异。本实验成功于各时间点解剖实验动物,并留取神经样本320个,置于4℃冰箱内避光保存,以备后续进一步锇酸染色、石蜡包埋或透射电镜等病理观察。结论:GBS相关C.jejuni灌胃联合百日咳毒素腹腔注射并不导致昆明雄鼠出现腹泻或瘫痪等表现,但可使小鼠出现运动功能显著下降及体重增长迟滞。第三部分:老老年急性缺血性脑卒中疾病分型目的:回顾性研究老老年(80岁及以上)缺血性脑卒中患者病因分型,并比较不同卒中分型患者入院期间神经功能缺损及短期预后的差异。方法:收集2013.9.14至2014.9.14于河北医科大学第二医院东院区神经内科连续住院的老老年急性缺血性脑卒中患者临床资料,包括主诉、现病史、既往史、实验室检查、影像检查等。由至少两名研究者对其进行进行牛津郡社区卒中计划分型(Oxfordshire Community Stroke Project 6Subtype Classification,OCSP分型)和ORG 10172急性卒中治疗试验分型(Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment Subtype Classification,TOAST分型),分型不一致者由神经内科主任医师级别医师进行最终分型的确定。使用Kruskal-Wallis检验及Nemenyi检验比较不同分型患者入院、出院时美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)评分,出入院NIHSS评分差值,以及出院时巴氏指数(Barthel Index)评分、改良的Rankin量表(modified Rankin Scale,m RS)评分,分析患者的卒中分型是否与入院期间神经功能缺损程度及短期预后相关。结果:1 2013.9.14至2014.9.14河北医科大学第二医院东院区神经内科共收住院患者3446人,老老年患者133人。其中老老年急性缺血性脑卒中患者69人,平均年龄83.6±3.6岁,男女比1.02:1。2 OCSP分型结果:完全前循环卒中(Total Anterior Circulation Infarcts,TACI)24.64%,部分前循环卒中(Partial Anterior Circulation Infarcts,PACI)28.99%,后循环卒中(Posterier Circulation Infarcts,POCI)21.74%,腔隙性梗死(Lacunar Infarcts,LACI)24.64%。TOAST分型结果:大动脉粥样硬化型卒中(Large Artery Atherosclerosis,LAA)18.84%,心源型卒中(Cardioembolism,CE)4.35%,小血管梗阻型卒中(Small Artery Occlusion,SAO)8.70%,不确定病因型卒中(Stroke of Undetermined Etiology,SUE)68.12%。3各OCSP亚型间入院、出院NIHSS评分(P<0.01)及出入院NIHSS评分差值(P<0.05)均具有显著性差异,各TOAST亚型间入院NIHSS评分(P<0.05)、出院NIHSS评分(P=0.01)具有显著性差异。各OCSP亚型间出院时m RS评分(P<0.01)、BI评分(P<0.01)具有显著性差异。各TOAST亚型间出院BI评分(P=0.01)、m RS评分(P=0.01)具有显著性差异。组间两两比较结果显示,除TACI型患者出入院NIHSS评分变化高于LACI组(P<0.05)外,余各组NIHSS变化无显著差异。TACI型患者出院、入院NIHSS评分较高,出院时BI评分较低、m RS评分较高;LAA型患者出院、入院NIHSS评分较高,出院时BI评分较低,提示两种类型患者神经功能缺损程度较重,短期预后不佳。CE型患者出院时m RS评分较高,BI评分较低,提示短期预后不佳。结论:1老老年急性缺血性脑卒中患者SUE型构成比增高。2不同OCSP分型、TOAST分型患者入院期间神经功能缺损程度及短期预后具有差异。