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大豆分离蛋白(SPI)是以脱脂豆粕为原料经过碱溶酸沉等方式制备而成的蛋白质产品,传统的提取工艺存在用水量高、提取率低、乳清废水排放量大等问题。本文以豆粕中蛋白质为研究对象,在基于质谱的蛋白质种类识别基础上,考察了提取条件对豆粕中不同种类蛋白质的释放行为的影响,建立基于多级逆流固液提取技术的SPI提取新工艺,在此基础上研究并建立大豆深加工行业乳清废水中高附加值蛋白的提取方法与综合利用,旨在降低提取过程用水量并提高蛋白质收率。主要结论如下:1.利用HPLC对蛋白提取物及乳清废水进行了分离,收集了分离出的主要蛋白质组分;采用酶解技术结合液质联用技术对分离出的蛋白质进行了种类识别。结果表明不同种类蛋白质的保留时间分布范围较宽,提取物中7S和11S组分中的蛋白质在色谱图中的保留时间主要集中在24 min以后,含有少量2S组分,乳清废水中主要是2S组分,其保留时间集中在24 min以前。采用飞行时间质谱和凝胶过滤色谱分析了蛋白提取物和乳清废水;结果表明,SPI的分子量范围为10 kDa-320 kDa,乳清废水的分子量范围为10 kDa-30 kDa。2.在蛋白质组分识别的基础上,对豆粕中的蛋白质溶出过程进行了监测,并对SPI提取过程中豆粕内各蛋白质组分的释放行为进行了研究。结果表明,2S组分释放速率较快,经过三次提取的相对释放量可达到90%以上;7S和11S组分释放速率较2S组分的释放速率低,四次提取的相对释放量达84%,提高提取过程中固相和液相之间的浓度梯度和延长7S和11S组分相对提取时间有利于提高7S和11S组分的释放速率。3.考察了多级逆流固液提取过程中提取条件对蛋白质总提取率、高分子量组分的酸沉率的影响。结果表明,采用多级逆流固液提取技术可在相同的蛋白质收率条件下用水量节省16%,同时由于提取液中较高的7S和11S浓度,在酸沉阶段7S和11S的收率较传统工艺中的酸沉阶段的收率提高3%。实现多级逆流固液提取工艺中试放大,获得的SPI中粗蛋白含量和氮溶解指数为分别为94.9%、99.4%,均高于传统提取工艺获得的SPI。4.利用疏水层析法对乳清废水中的胰蛋白酶抑制剂进行纯化,并利用HPLC和MALDI-TOF对纯化结果进行表征。结果表明,疏水层析法可对胰蛋白酶抑制剂进行有效的分离纯化,并以纯化的胰蛋白酶抑制剂为配基,环氧活化的琼脂糖凝胶为载体制取亲和介质,以标准的胰蛋白酶溶液为样品对亲和层析介质进行表征。结果表明,制取的两种亲和介质均能实现对胰蛋白酶的纯化。本研究将多级逆流固液萃取技术应用于SPI提取,并考察了不同提取条件对蛋白质收率及释放速率的影响,同时对乳清废水中的胰蛋白酶抑制剂进行了分离纯化,对建立节水和提高蛋白收率的SPI提取工艺具有重要的参考价值。