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目的:比较小鼠在热中性温度30?C,室温23?C,低温6?C环境中,肝脏脂滴及线粒体蛋白的变化,探讨小鼠肝脏在不同环境温度下糖脂代谢的变化及其机制。方法:将小鼠分别在三个温度下饲养1个月,分离纯化肝脏的脂滴,线粒体,进行比较蛋白组学分析,以及生化实验验证,结合生物信息学方法,分析小鼠肝脏在不同环境温度下糖脂代谢的变化。1.小鼠处理及肝脏变化分析:选取10周龄的C57BL/6雄鼠18只,随机分为3组,每组6只,分别饲养于热中性温度30?C,室温23?C,低温6?C,三个温度的培养箱中,每笼1只,喂食普通饲料,饲养1个月。1个月后断颈处死,测定肝脏重量、体重、糖原、甘油三酯。2.小鼠肝脏脂滴和线粒体的纯化:分别用蔗糖密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法分离纯化小鼠肝脏脂滴(lipid droplets,LDs)及线粒体(mitochondria,MT)。3.纯化的脂滴和线粒体的质量评估:将纯化的脂滴、线粒体染色后进行形态学分析;对其蛋白进行电泳分离后进行银染分析;以及通过蛋白质免疫印迹方法,进行不同细胞组分标志蛋白的富集分析。4.脂滴及线粒体蛋白比较蛋白组学研究:利用6标串联质谱标签(tandom mass tag,TMT)标记的定量蛋白质组学方法进行比较蛋白组学分析,分别将纯化的脂滴及线粒体进行蛋白提取,酶解,TMT标记,质谱数据采集及蛋白鉴定,进而进行差异蛋白筛选、生物信息学分析。5.比较蛋白组学数据验证:对组学筛选得到的差异基因进行蛋白免疫印迹分析,从而对组学数据的可靠性进行验证。6.结合比较蛋白组学结果,及生物信息学分析,分析肝脏在不同环境温度下,糖代谢及脂代谢通路的变化。结果:1.不同温度饲养的小鼠,体重没有出现明显的异常。但6?C饲养一个月的小鼠,肝脏与体重比明显高于23?C和30?C饲养的小鼠(P(27)0.05)。与小鼠30?C热中性温度中饲养的小鼠相比,6?C饲养的小鼠,肝脏糖原显著减少(P(27)0.05)。与23?C饲养组相比,30?C和6?C饲养的小鼠甘油三酯含量明显增加(P(27)0.05)。2.利用密度梯度离心方法,我们分别纯化了小鼠肝脏的脂滴和线粒体。LipidTOX Red及MitoTracker染色及形态学分析表明,纯化的脂滴及线粒体中其他细胞器污染很少。银染及蛋白免疫印迹分析表明,脂滴及线粒体组中,其标志蛋白均被明显富集,而其他细胞组分的标志蛋白含量很少。这些结果表明我们获得了高纯度的脂滴及线粒体。3.对6?C&23?C,6?C&30?C,23?C&30?C饲养的小鼠,其线粒体蛋白质组学数据分别进行分析,结果表明:与23?C饲养组相比,6?C饲养组小鼠的甾类激素合成过程下调;与30?C饲养组相比,6?C条件下,小鼠肝脏线粒体视黄醇代谢和三羧酸循环明显上调,而氧化磷酸化并无明显变化;与30?C饲养组相比,23?C条件下小鼠的甾类激素合成过程和视黄醇代谢上调。4.对差异蛋白进行蛋白免疫印迹验证,结果表明与组学分析发现的差异蛋白变化趋势一致,包括,脂滴蛋白质组学数据中ADRP/PLIN2,OXPAT/PLIN5,Rab18的变化,线粒体蛋白质组学数据MPC1,MPC2,MUP1,Prohibitin,VDAC的变化。结论:1.不同饲养温度,对小鼠肝脏的重量、糖脂代谢有显著的影响。因此,在进行动物实验进行科学研究时,饲养温度,尤其是热中性温度,可能需要受到关注。2.我们分离纯化了高纯度的肝脏脂滴及线粒体,并获得了三个温度下,可靠的肝脏脂滴及线粒体比较蛋白组学数据。3.线粒体比较蛋白质组数据的分析表明,肝脏可能通过增加三羧酸循环来供给生物合成途径的原料,以及提高视黄醇代谢能力,来适应外界的低温环境。4.脂滴蛋白PLIN5,线粒体丙酮酸转运蛋白MPC以及主要尿蛋白MUPs可能在温度影响肝脏糖脂代谢过程中,以及参与肝脏适应低温环境中,发挥了重要作用。