百草枯(PQ)对人畜毒性较强,可经皮肤、呼吸道、消化道吸收造成急性中毒。PQ中毒是我国常见农药中毒,易并发肺间质纤维化和多脏器损伤。PQ中毒无特效解毒剂,治疗效果差,死亡率高。PQ进入体内后分布广泛,在肺及骨骼肌组织中浓度最高。PQ中毒后6天,仍能在患者心肌、肺脏、肾脏和肝脏等组织中检测到PQ。PQ通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)电压依赖阴离子通路1诱导细胞线粒体产生超氧阴离子导致细胞毒性。急性PQ中毒早期肺泡II型细胞通过多胺摄取系统使PQ在肺脏肺泡上皮细胞内聚集。PQ中毒导致的肺纤维化发生率和死亡率较高,没有特效治疗PQ中毒的方法。PQ通过促进肺脏细胞凋亡,细胞外基质降解,上调炎症因子表达和降低抗氧化基因表达等机制导致肺脏损伤。PQ中毒早期通过促进炎症反应、细胞凋亡、增加细胞外基质降解导致急性肺损伤;后期通过纤维母细胞活化,基质胶原蛋白降解减少等途径导致肺间质纤维化病理改变。细胞外基质的代谢失衡是肺纤维化形成过程中极为重要的病理生理基础。基质金属蛋白酶包括多种蛋白酶,其中金属基质蛋白酶(MMP-9)的主要作用底物为Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原,弹性蛋白、粘连蛋白、蛋白聚糖核心蛋白和明胶等。MMP-9基因位于染色体20qll.1～13.1,大小为26～27kbp,具有13个外显子和9个内含子。我国学者发现急性PQ中毒大鼠肺组织MMP-2,MMP-9和TIMP-1基因表达明显增加,MMP/TIMP-1表达失衡参与PQ中毒导致的肺纤维化过程。肺纤维化患者的多个基质金属蛋白酶在基因转录水平和蛋白表达方面增加,参与肺纤维化的结构重塑。肺泡上皮细胞和肺间质之间存在一个交互对话,肺泡上皮细胞受损后可以通过交互对话形式促进细胞外基质的增生导致肺纤维化发生。WNT1诱导信号蛋白1(WISP1)是新发现的CCN家族分泌信号分子,肺纤维化动物模型和纤维化患者肺泡细胞中WISP1以自分泌和旁分泌方式上调MMP-9基因表达,促进肺泡上皮细胞增殖、纤维母细胞活化,细胞外基质胶原沉积导致肺纤维化的发生。检索国内外文献,未见到WISP-1在PQ中毒导致的肺纤维化中作用的报道。通过WISP在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition EMT)和在肺纤维化中作用机制的研究报道,我们推测WISP1通过上调MMP-9基因表达,导致PQ中毒患者肺组织细胞外基质代谢失衡参与了 PQ中毒导致的肺纤维化过程。因此,我们拟通过检测PQ中毒患者WISP1基因和MMP-9基因表达,PQ干预A549细胞MMP-9、WISP1表达,来研究WISP1在QP中毒导致肺纤维化的作用机制。关于PQ中毒导致死亡的危险因素有很多报道,研究表明急性PQ中毒患者血浆PQ浓度、服毒量、APACHEII评分等是急性PQ中毒患者预后的危险因素。因此我们随访观察3年来我院收治PQ中毒患者,以探讨PQ中毒预后相关危险因素。PQ并发肺间质纤维化的发生率较高,但是较少有关于PQ中毒后发生肺纤维化的危险因素报道。我们通过随访观察PQ中毒患者肺脏变化情况,并对其住院期间APACHE评分、各项化验指标进行统计分析,以判断PQ中毒并发肺纤维化的危险因素。目的:测定PQ中毒患者外周血单核细胞中MMP-9、WWISP1基因表达,血清MMP-9、WISP1蛋白浓度。观察体外条件下PQ对肺泡细胞的EMT作用,MMP-9、WISP1在细胞中的表达,WISP1对EMT和MMP-9表达影响,探讨PQ体内体外对MMP-9、WISP1基因表达的影响。随访PQ中毒患者预后与肺纤维化发生情况,通过检测PQ中毒患者血清PQ浓度、各项化验室指标和APACHE评分,观察这些临床指标与PQ中毒患者预后和肺纤维化间的关系,寻找可以帮助判断患者预后和肺纤维化发生的可靠指标。方法:一、体内试验1、观察并随访自2012年1月至2014年12月收治的120例PQ中毒患者,分析与PQ中毒预后及并发肺纤维化危险因素。从上述病人中选择2013年1月至2014年6月,根据入组标准共选择37例PQ中毒患者进行基因检测,纳入同期健康体检者作为健康对照组。2、试验分组:随访PQ中毒患者,根据中毒治疗结果将PQ中毒患者分为死亡组、存活组、肺纤维化组和无肺纤维化组。健康人做为健康对照组。3、RT-PCR方法测定MMP-9和WISP1基因的表达。4、ELISA方法测定血清中MMP-9、WISP1蛋白浓度。5、高效液相色谱法测定血清PQ浓度。6、患者中毒第1天、第3天进行APACHEII评分,收集患者入院后血、尿常规、实验室生化指标,随访PQ中毒患者存活和肺纤维化情况,分析这些指标与患者预后和肺纤维化的关系。二、体外实验1、培养A549细胞,用PQ处理,根据PQ不同浓度分为PO组,P50组,P100组,P200组和P400组。光镜下观察各组A549细胞形态。2、Western Blot法测定细胞MMP-9、WISP1 和E-cadherin、Vimentin蛋白浓度。3、荧光定量RT-PCR法测定细胞MMP-9、WISP1的基因表达情况。4、用WISPlsiRNA处理A549细胞,分为PO组、P200组,NC组、W组。Western Blot方法检测WISP1、MMP-9、E-cadherin和Vimentin蛋白表达。三统计方法用SPSS19.0统计软件,用方差分析、t检验、Spearman相关分析和Logistics回归方法进行统计分析。结果:一、体内试验1、PQ中毒患者MMP-9基因表达和蛋白浓度高于正常对照组,死亡组患者MMP-9基因表达高于存活组,肺纤维化组高于无肺纤维化组,差异均有显著性(p<0.01)。2、肺纤维化组患者MMP-9基因表达中毒第1d(t=5.269,p<0.01),中毒第3d(t=5.435,p<0.01)均高于无肺纤维化组。3、PQ中毒患者WISP1基因和蛋白浓度表达均高于正常对照组,死亡组高于存活组,肺纤维化组高于无肺纤维化组,差异均有显著性(p<0.01)。4、中毒第1dWISP1基因表达与第1d MMP-9基因表达(r=0.822,p<0.01)正相关,与第3dMMP-9基因表达量(r=0.852,p<0.01)正相关。中毒第3dWISP1基因表达与第3d MMP-9基因表达也呈正相关(r=0.664,p<0.01)。5、PQ中毒患者死亡组服毒量大于存活组(p<0.01),死亡组血清PQ浓度显著高于存活组(p<0.01),肺纤维化组患者血清PQ浓度高于无肺纤维化组(p<0.01)。6、血清PQ浓度与MMP-9基因蛋白呈正相关。血清PQ浓度与中毒第1d基因表达(r=0.672,p<0.01),中毒第3dMMP-9基因表达(r=0.703,p<0.01)正相关。血清PQ浓度与第1dMMP-9血清蛋白浓度(r=0.596,p<0.01),第3dMMP-9蛋白浓度(r=0.705,p<0.01)呈正相关。7、血清PQ浓度与中毒第1d WISP1基因表达(r=0.621,p<0.01)正相关,与中毒第3d WISP1基因表达量(r=0.164,p=0.34)无明显相关性。PQ浓度与第1dWWISP1血清蛋白浓度(r=0.596,p<0.01),第3dWISP1蛋白浓度(r=0.447,p<0.01)也呈正相关。8、PQ中毒患者死亡组APACHEII评分高于存活组(p<0.01),肺纤维化组患者APACHEII评分高于无肺纤维化组(p<0.01)。中毒第3d评分分值高于第1d(p<0.01)。9、中毒患者APACHE II评分分值、尿素氮、肌酐、淀粉酶、谷草转氨酶以及合并肺纤维化是PQ中毒导致死亡的危险因素。10、APACHE评分分值、MMP-9基因表达和MMP-9蛋白浓度、尿素氮、肌酐、血糖、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、服毒量、白细胞数量和中性粒细胞数量是PQ中毒并发肺纤维化的危险因素。二、体外实验1、光镜下可以观察到A549细胞形态由上皮形态向间质细胞形态改变。400ugPQ处理导致细胞凋亡明显。2、E-cadherin在P100组、P200组、P400组E-cadherin明显下降,显著低于PO组(p<0.01)和P50组(p<0.01),其中以P200组下降最为明显。3、Vimentin随着PQ的浓度增加而变化,P50组Vimentin表达最明显,较PO组和其他三组均明显上升(p<0.01)4、100ugPQ处理第2d时E-cadherin较第Id明显升高(p<0.05),第3d时E-cadherin下降与第1d接近。Vimentin在细胞培养第2d下降,Vimentin在培养第3d升高,和培养第1d接近。5、Western Blot方法检测均发现随着PQ浓度增加,MMP-9和WISP1蛋白浓度均增加,差异均有显著性(p<0.01)。200ugPQ处理后随着时间延长,MMP-9和WISP1基因表达均增加,差异均有显著性(p<0.01)。6、WISP1 siRNA可抑制PQ导致的EMT变化,W组较P200组和NC组E-cadherin表达增加,Vimentin表达下降,差异均有显著性(p<0.01)。7、WISP1 siRNA可抑制PQ诱导的MMP-9表达增加,W组MMP-9表达较P200组和NC组下降,差异具有显著性(p<0.01)。结论:1、PQ在体内、体外均可诱导MMP-9和WISP1表达增加。2、PQ诱导肺泡细胞发生EMT。3、WISP1促进PQ诱导的EMT发生和MMP-9表达增加。4、血清PQ浓度、MMP-9表达、APACHEⅡ评分分值、BUN、Cr数值可用于预测PQ中毒肺纤维化的发生。5、PQ中毒患者MMP-9表达、白细胞、中性粒细胞、肝肾功能指标和血糖、淀粉酶升高是PQ中毒患者预后不良指标。6、WISP1通过促进EMT,上调MMP-9表达在PQ导致的肺纤维化中发挥重要作用。