香兰素(Vanillin，Vin)是食品工业和日化工业极其重要的添加剂，也是某些合成药物的中间体，是目前世界上应用最广的香料之一。但是目前市售的香兰素绝大部分都是化学合成的，化学合成香兰素时污染很大，而且产品对人体可能产生毒副作用。而从香荚兰豆中提取的天然香兰素价高量少，远远不能满足国内外市场的需求。目前最新发展的技术是生物合成香兰素，生物合成的香兰素被视为天然香兰素的等同品。生物合成香兰素的方法主要有微生物发酵法、酶工程法、细胞工程法等。 考虑到技术可行性和经济性，我们设计了以阿魏酸为原料，利用基因工程菌，通过辅酶A的去乙酰反应途径二步合成香兰素的方案。第一步就是通过阿魏酰辅酶A合成酶(Fcs)、烯酰基辅酶A水解酶/醛缩酶(Ech)和香兰素脱氢酶(Vdh)把阿魏酸转化成香草酸，第二步是把香草酸还原为香兰素。我们设计的二步法由于Vdh能迅速将香兰素转化为毒性相对较低的香草酸从而将克服采用一步法时由于香兰素化学活性很高而且对微生物有较大的毒性，以致香兰素得率很低的问题。 在本论文中克隆了我实验室保藏的荧光假单胞菌的香兰素合成酶基因，并对Vdh的基因(vdh)进行了表达和功能验证，取得了以下成果： 1．从实验室保藏的几株假单胞菌中筛选出含有香兰素合成酶基因(阿魏酰辅酶A合成酶的基因fcs；烯酰基辅酶A水合酶/醛缩酶的基因ech；和香兰素脱氢酶的基因，vdh)的荧光假单胞菌。 2．通过LA PCR技术，获得了香兰素合成酶基因的完整序列，避免了构建基因文库的繁杂。并与己知的香兰素合成酶基因序列进行了分析比较，发现它们具有高度的同源关系。 3．测定了大肠杆菌对阿魏酸、香兰素酸和香兰素的耐受能力，验证了香兰素对微生物有较大的毒性并筛选出宿主菌E．coliDH<,5>。 4．将克隆得到的vdh基因成功地在重组大肠杆菌中进行了表达；36小时摇培发酵后，重组菌能把92％以上的香兰素底物转化为香兰素酸，这就进一步验证了荧光假单胞菌vdh基因表达后能高效行使把香兰素氧化成香兰素酸的功能。 这样就为利用廉价的碳源通过两步法合成香兰素打下了坚实的基础，从而开辟了生物合成香兰素的新途径。