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鸭沙门氏菌病,俗称鸭伤寒病。是雏鸭、肉鸭、番鸭、樱桃谷鸭等多种家禽的急性或慢性传染病。其临床症状主要表现为患鸭精神沉郁、食欲废绝、腿软、脚掌发干,出现乍毛、下白痢等,发病率和死亡率可分别高达75%和60%。鸭沙门氏菌病的病原为沙门氏菌属中的一些血清型,最常见的是鼠伤寒沙门氏菌,占75%～95%；其次是肠炎沙门氏菌,约占11.3%；鸭沙门氏菌,约占4.7%；鸡白痢沙门氏菌约占1%。目前对禽类沙门氏菌病的研究主要是集中在陆禽(鸡),受感染的鸡肉和鸡蛋能够经食物链将沙门氏菌传染给人。与欧洲以及美洲多数国家不同的是,我国是传统的鸭养殖与消费大国,鸭肉以及鸭蛋的产量居于全世界第一位,因此,我国居民因食用受污染的鸭肉以及鸭蛋而感染沙门氏菌病的几率较其他国家会更高。本文对沙门氏菌快速检测方法、我国部分地区肉鸭沙门氏菌流行情况、鸭源鼠伤寒沙门氏菌基因缺失减毒株构建及疫苗用前景评价等开展研究,获得了以下的研究结果：1.建立了基于fimY基因的沙门氏菌属特异性LAMP检测方法(fimY-LAMP)通过多重序列比对,我们在fimY基因的保守区域设计了3对引物,建立了fimY-LAMP检测法。该方法在纯培养条件下每反应管能够分别检测到6.0 CFU以及4.8 CFU的肠炎沙门氏菌(S.enterica)和鸭沙门氏菌(S.anatis),而常规的PCR检测法只能分别检测到60 CFU以及48 CFU的肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌。此外,在有外源DNA干扰如：人工混入0.01g鸭肝脏或脾脏DNA的条件下,fimY-LAMP法每反应管仍然能够检测到6.0 CFU的肠炎沙门氏菌。2.我国部分地区鸭源沙门氏菌的检测、分离和鉴定运用fimY-LAMP法对临床采集或送检的部分样本进行了沙门氏菌的快速检测,结果表明178份样本(115份鸭肝脏以及63份鸭脾脏样本)中有12份样本的检测结果为阳性。进一步分离,我们得到了12株沙门氏菌。此外,从部分地区采集的153份健康鸭的肛门拭子中,我们分离得到了6株沙门氏菌。全部18株沙门氏菌血清型鉴定结果均为鼠伤寒沙门氏菌。3.鸭源鼠伤寒沙门氏插入突变株和完全缺失株构建从18株鸭源鼠伤寒沙门氏菌中筛选得到一株不含有氨苄、卡那、氯霉素以及四环素抗性的鼠伤寒沙门氏菌,命名为TT-1。以TT-1作为亲本株构建了7个含有四环素抗性的插入突变株,分别为：T7-3(△hilA::tetRA)、T7-A(△ssrB::tetRA)、TT-5(△ phoP/phoQ::tetRA)、77-6(△ompRr::tetRA)、TT-7(△rpoS::tetRA)、77-%(△ slyA::tetRA)以及TY-9(△clpP::tetRA);7个消除了四环素抗性的完全缺失株,分别为TT-17(△ hilA)、TT-lZ(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、T7-20(△ompR)、TT-21(△rpoS)、TT-22(△ slyA)以及TT-23(△clpP)。4.亲本株及缺失株毒力、缺失株在鸭体内的定殖与代谢亲本株TT-1对1日龄雏鸭的口服LD50值为1.2×108CFU。敲除了hilA、slyA或者rpoS基因的缺失株TT-17(△hilA)、TT-22(△sfyA)以及TT-21(△rpoS)对1日龄雏鸭的减毒效果并不明显,而ssrB、phoP/phoQ、ompR以及clpP基因缺失后的菌株TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoO)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)对1日龄雏鸭的减毒效果十分明显,4个缺失株的口服LD50值均大于100倍亲本株TT-1的口服LD50值。用含有四环素抗性的插入突变株TT-4(△ssrB::tetRA), TT-5(△ phoP/phoQ::tetRA)、 TT-6 (△ ompR::tetRA)以及TT-9(△clpP::tetRA)来分别模拟TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)这4个缺失株在鸭子体内主要靶器官肝脏和脾脏的定殖和代谢情况。结果表明虽然TT-18(△ ssrB)、TT-20(△owpR)以及TT-23(△clpP)这三个缺失株对1日龄雏鸭的毒力降低了,但是它们仍然能够定殖在鸭子的肝脏和脾脏。其中TT-4(△ssrB::tetRA)突变株在鸭子肝脏和脾脏的停留时间超过了28天,表现出潜伏感染的特性。而TT-5(△ phoP/phoQ::tetRA)突变株在整个试验周期内一直无法定殖于鸭子的肝脏和脾脏。5.疫苗候选株TT-18(△ ssrB)、 TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)的免疫保护力我们观察到1日龄雏鸭在口服免疫了106CFU的TT-18(△ssrB)、TT-19(△ phoP/phoQ)、T7-20(△ompR)或者TT-23(△clpP)后第7天均能100%的抵御10’0CFU野毒株TT-1的口服感染,而阴性对照组则有60%的鸭子死亡。1日龄雏鸭口服接种了108CFU的TT-18(△ssrB)或TT-23(△clpP)缺失株后第7天分别有85%和80%的雏鸭能够抵御1010CFU野毒株TT-1的口服感染。6.建立了基于鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白的ELISA检测法,并运用该方法对免疫鸭子血清中的特异性IgM、IgG以及胆汁中特异性的IgA抗体进行了分时检测,同时还对诱导产生的功能性抗体进行了相应评价对疫苗株TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(AompR)以及TT-23(△clpP)进行体液免疫评价时,我们发现这4个缺失株均能诱导鸭子产生特异性的IgM, IgG以及IgA抗体。其中特异性的IgM抗体产生的时间最早,于感染后第5天便能够在免疫鸭子的血清中被检测到；IgG其次,于免疫后第7天出现在免疫鸭子的血清中；特异性IgA抗体出现的时间最晚,于感染后第14天才从免疫鸭子的胆汁中被检测到。对比不同菌株诱导产生的特异性抗体滴度,我们发现在鸭子体内停留时间较长的TT-18(△ssrB)以及TT-23(△clpP)缺失株刺激鸭子产生的特异性抗体的滴度和维持的时间也较长。而在鸭体内停留时间较短或无法停留的TT-20(△ompR)和TT-19(△phoP/phoQ)刺激鸭机体产生的特异性抗体的滴度和维持的时间也较短。与ELISA检测结果稍有不同的是,诱导相对较少特异性抗体的TT-20(△ompR)块失株却诱导了较多的功能性抗体,其诱导的免疫血清对亲本株TT-1的生长抑制作用较TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、以及TT-23(△clpP)试验组更加显著(P<0.01)。7.应用ELISA方法对免疫鸭子血清中IFN-γ、IL-2、IL-4的含量进行了分时检测在免疫了TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)后不同的时间点,我们采集了免疫鸭子的血液,分离血清后检测了其中IFN-γ、IL-2、IL-4的含量。结果表明免疫鸭子血清IL-2的含量在免疫后第3天开始增加,而第7天后开始逐步降低。血清IFN-γ的含量在免疫后第5天开始增加,到了第35天后开始衰减。与IFN-γ含量的变化正好相反,免疫鸭子血清中IL-4的含量在第7天开始降低直至免疫后第35天才恢复至免疫前的水平。基于这样的试验结果,我们认为这4个突变株均诱导了Th-1细胞介导的免疫反应。