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马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)与人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)同属于逆转录病毒科慢病毒属。EIAV是感染马属动物的重要传染病病原和用于慢病毒相关研究的重要模型病毒。上世纪七十年代,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成功研制出EIAV中国弱毒疫苗株。该疫苗株能够诱导马属动物产生良好的免疫保护,是唯一成功大规模应用的慢病毒疫苗株。对于EIAV亲本强毒株致弱过程中的各代次不同毒力的毒株,尤其最终获得的疫苗弱毒株的生物学特性研究,将对研究有效慢病毒疫苗提供借鉴,具有重要的科学意义。前期研究发现,即便宿主的免疫系统受到抑制,该疫苗株仍能保持其稳定的低水平复制,提示是病毒自身的弱化,而不是宿主的免疫系统,是EIAV弱毒疫苗株体内低水平复制的主要原因。逆转录病毒能够将其基因组以前病毒DNA的形式整合到宿主基因组,已有研究提示,前病毒DNA发生整合的宿主基因组环境对病毒的转录和复制有明显影响。EIAV,特别是EIAV中国弱毒疫苗株的宿主基因组整合特性如何?是否与其在宿主体内的低水平复制相关?对这些问题解答,有助于进一步了解EIAV弱毒疫苗株毒力致弱的机制。本研究以EIAV致弱过程中的3个关键毒株,即驴白细胞适应性强毒株EIAVDLV34、驴白细胞适应性弱毒疫苗株EIAVDLV121、以及驴胎皮肤细胞适应性弱毒疫苗株EIAVFDDV13为研究对象,我们对各毒株在马基因组上的整合位点选择特征进行了实验研究,重点比较了强、弱毒株在整合位点选择上是否存在差异,并基于获得的实验数据,尝试探究EIAV疫苗弱毒株对宿主基因组的整合特征与其毒力弱化间的可能关联。开展的具体实验研究为:用EIAVDLV34和EIAVDLV121体外分别感染马巨噬细胞,用EIAVFDDV13感染马胎皮肤细胞。提取被感染细胞的基因组DNA,并经限制性内切酶Ssp I与Dra I片段化后,与DNA接头连接。使用接头介导的聚合酶链式反应(Linker-mediated PCR,LM-PCR)扩增EIAV前病毒整合位点接头序列,再经克隆、测序,判定并获得准确的整合位点序列信息。本研究中,我们成功地获得了共计1,103个EIAV整合位点信息,具体包括EIAVDLV34感染组的101个位点信息,EIAVDLV121感染组的525个位点信息,以及EIAVFDDV13感染组的477个位点信息。对以上获得的整合位点信息,完成以下六方面特性分析:①染色体定位、②插入基因频率、③前病毒相对于转录起始位点的插入方向、④整合位点相对于转录起始位点的距离、⑤是否插入重复元素、⑥整合有EIAV前病毒的宿主基因的功能注释(Gene ontology,GO)分析。分析结果表明,首先,三种EIAV毒株在马基因组上发生的整合事件是非随机性的。其次,各毒株的整合特征间具有一定程度的共性和差异。共性之处在于:①三种EIAV毒株均对马基因组上转录单位(Transcription units,TUs)区域,尤其内含子具有明显的偏向性(P<0.01);②在整合位点处均形成较弱的回文结构;③整合过程倾向发生在基因组上富含AT的区域、④基因密度为21~40个/2Mb的基因组区域和⑤长散在核元素(Long interspersed elements,LINEs),其中LINE1尤其支持EIAV发生整合事件(P<0.01),这不同于HIV-1,后者倾向于在短散在核元素(Short interspersed elements,SINEs)发生整合。⑥但EIAV对于SINEs和转录起始位点无任何偏向性。⑦此外,GO分析表明,3种EIAV毒株前病毒均插入负责转录调节、离子结合与ATP结合功能的宿主基因簇。不同之处在于:①除LINE1外,在染色体上其它种类的重复元素中,DNA支持两种弱毒疫苗株EIAVDLV121和EIAVFDDV13发生整合事件(P<0.05);②EIAVDLV121和EIAVFDDV13也在低基因密度区域(11~20个/2Mb)发生整合;③GO分析结果也表明,整合有疫苗弱毒株EIAVDLV121和EIAVFDDV13的前病毒的宿主基因也负责DNA损伤刺激反应、宿主适应性免疫反应、淋巴细胞分化、凋亡、脂筏的合成过程和氧化还原生物学过程。此外,与已有关于EIAV载体(VSV-G)对人类基因组整合特征的比较分析,可以发现:①EIAV整合特征与其感染宿主选择的路径无关(EIAV env或者VSV-G);②无论对人或马,宿主基因组的转录单位均倾向于被EIAV选择作为整合位点。基于以上研究,一方面我们发现EIAV前病毒DNA高频率地插入LINEs及DNA转座子,而LINEs及DNA转座子具有影响其附近基因转录及表达的作用,因此存在EIAV前病毒通过插入该区域对自身复制等过程产生反馈性抑制的可能,进而与病毒毒力弱化产生关联;另一方面,一些整合有疫苗弱毒株前病毒的宿主基因参与免疫反应相关生物学过程,是否与其诱导良好的免疫保护有关,也是值得进一步深入探讨的课题。本研究获得的全部研究信息,将促进我们对EIAV,尤其EIAV中国弱毒疫苗株生物学特性的更多了解。同时,对EIAV在马基因组上的整合位点选择特征的探讨,将为进一步研究慢病毒感染与宿主应答间的相互作用特征,以及为以慢病毒为转基因治疗载体的相关研究,提供重要数据支持。