磺酰脲类除草剂是一类含有磺酰脲桥结构的选择性除草剂,可用于防除多种杂草,自问世以来便受到广泛应用。烟嘧磺隆是磺酰脲类除草剂中的一种,具有高效、低毒、广谱和对哺乳动物无毒等优点,但因其长期使用与不合理滥用,造成其在环境中的积累,例如土壤中和水源中,对部分土壤以及水源造成污染,其中烟嘧磺隆在土壤中的残留易引起后茬敏感作物的药害现象,严重时可造成减产、甚至绝收。因此,土壤中烟嘧磺隆的残留药害问题引起研究者的关注,而如何解决土壤中的烟嘧磺隆残留也越来越重要。目前针对土壤中的烟嘧磺隆残留,多采用生物修复的途径,其中微生物修复途径应用较为广泛,具有高效率、低成本、无二次污染、降解彻底等优点,是目前解决除草剂在土壤中残留的行之有效的方法。本研究前期从烟嘧磺隆生产厂的污水中分离得到了两株烟嘧磺隆高效降解菌株,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌YB1和黑曲霉YF1。经研究得知YB1菌株主要通过分泌胞外酶的方式来降解烟嘧磺隆,从YB1菌株的胞外酶中分离纯化获得3种烟嘧磺隆降解酶,经鉴定分别为锰结合ABC转运酶、植物过氧化氢酶1和乙偶姻脱氢酶E1。YF1菌株则通过化学水解和微生物降解共同作用来降解烟嘧磺隆,一方面通过菌株自身生长中分泌草酸来使烟嘧磺隆发生水解,另一方面则通过分泌胞外酶来实现对烟嘧磺隆的降解。1.本研究通过Illumina HiSeq PE150测序平台获得了YB1菌株和YF1菌株的基因组信息,其中YB1基因组大小为3.30 Mb,编码基因数为3882,编码区域的长度为3,698,092 bp。YF1基因组大小为9.19 Mb,编码基因数为6866,编码区域的长度为35,215,337 bp。通过两种菌株的基因组信息以及相关软件的预测,我们预测得到了YB1基因组中4种与烟嘧磺隆降解相关的酯酶基因,9种水解酶基因,同时对YB1中三种降解酶的基因进行了准确的基因定位,获得了3种降解酶的完整基因信息;YF1基因组中7种与烟嘧磺隆降解相关的水解酶基因,这些预测得到的基因在降解烟嘧磺隆方面具有很大的潜力。2.在获得锰结合ABC转运酶、植物过氧化氢酶1和乙偶姻脱氢酶E1三种降解酶的完整基因信息的基础上,采取异源表达的方式获得了3种降解酶的可溶性酶溶液。采用活性测定的方法检测3种降解酶溶液对4种磺酰脲类除草剂的活性,活性结果显示3种降解酶对烟嘧磺隆均具有降解活性,对苄嘧磺隆、甲嘧磺隆以及苯磺隆活性不具降解活性。为进一步研究3种降解酶对烟嘧磺隆的特殊的降解活性,采用计算机分子模拟的方法和表面等离子体共振技术共同研究了3种降解酶与烟嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲嘧磺隆以及苯磺隆之间的相互作用,其中表面等离子体共振技术表明3种降解酶与烟嘧磺隆和苄嘧磺隆之间存在特异性结合作用,与甲嘧磺隆和苯磺隆之间没有结合;分子模拟对接结果显示,3种降解酶与4种除草剂分子之间均有结合作用,这与表面等离子体共振检测获得的结果以及实际检测到的活性结果并未一致,但是分子模拟对接结果直观的将降解酶与除草剂分子之间的结合状态展示出来,并且对存在的相互作用力有明确的分类和展示。两种技术均验证了降解酶与除草剂分子之间的相互作用,但具体的降解机制仍需进一步研究。对于降解酶催化降解烟嘧磺隆的反应,本研究采用液质联用技术检测了YB1菌株以及降解酶降解烟嘧磺隆的产物种类,并发现采用ECOSAR软件预测烟嘧磺隆以及其降解产物对水生和陆生生物的急性毒性结果与实际试验结果具有较高的一致性,这将大大减少农药分子对环境生物的毒性测定工作,为其它农药分子的环境风险评估提供指导。3.为进一步研究YB1菌株对烟嘧磺隆的修复效果,采用前期成熟的颗粒剂加工技术将YB1菌株进行发酵,制备颗粒剂,进而采用室内盆栽的方式对YB1降解土壤中的烟嘧磺隆残留进行了田间模拟修复,以小麦为敏感指示植物,同时对土壤中烟嘧磺隆残留的浓度的检测,测定了YB1菌株颗粒剂对土壤中的烟嘧磺隆残留的修复效果。同时检测了各组中土壤酶活性的变化和土壤微生物多样性的变化,以确定YB1颗粒剂对土壤中烟嘧磺隆的降解效果和对其其它微生物群落的影响。结果发现YB1颗粒剂对土壤中烟嘧磺隆残留的降解效果良好,且对土壤中其它微生物群落结构不造成影响。4.针对YF1菌株降解烟嘧磺隆的研究,通过利用硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换、非变性凝胶电泳以及变性凝胶电泳的方法从YF1菌株胞外酶中分离得到了两种常见的胞外酶,葡糖淀粉酶和脂肪酶2。通过优化培养基类型,培养温度和培养时间三方面对YF1菌株进行培养,大大提高了胞外酶-葡糖淀粉酶和脂肪酶2的产量。对分离纯化得到的葡糖淀粉酶和脂肪酶2来进行烟嘧磺隆降解活性的测定,获得了葡糖淀粉酶和脂肪酶2降解烟嘧磺隆的基础性质,证实了葡糖淀粉酶和脂肪酶2对烟嘧磺隆的催化降解功能。综上分析,本研究初步解释了枯草芽孢杆菌YB1和黑曲霉YF1菌株对烟嘧磺隆的降解作用,检测了3种异源表达获得的降解酶对烟嘧磺隆的降解活性,并获得2种新的烟嘧磺隆降解酶,测定了该2种降解酶对烟嘧磺隆的基础降解性质,丰富了烟嘧磺隆降解酶与降解基因的资源。通过分子模拟对接和表面等离子体共振技术研究了降解酶与烟嘧磺隆之间的相互作用,为研究其它菌株和降解酶与除草剂的相互作用提供参考。同时本研究在烟嘧磺隆降解菌株的应用上进行探究,明确YB1菌株颗粒剂的降解效果以及环境友好特性,为解决环境中烟嘧磺隆污染的土壤修复问题提供思路。