[研究背景]2010年5月经中国疾病预防与控制中心病毒病所专家证实,在一类以“发热伴血小板减少综合征”为主要临床表现的患者血清中发现了一种新型布尼亚病毒,并命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV)。该病毒属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae),白蛉病毒属(Phlebovirus),病毒颗粒呈球形,直径80-100nm,外有脂质包膜,表面有棘突。基因组包含三个单股负链RNA片段(L、M和S),L片段全长为6368nt,包含单一读码框架编码RNA依赖的RNA聚合酶；M片段全长为3378nt,包含单一读码框架编码1073个氨基酸的糖蛋白前体；S片段全长为1744nt,为一双义RNA,基因组以双向的方式分别编码病毒核蛋白NP和非结构蛋白NSs。病毒基因组两端的11个碱基序列呈高度保守,与白蛉病毒属其他病毒成员相同,可形成锅柄状的二级结构。已知的其他的布尼亚病毒科病毒抵抗力弱,不耐酸、易被热、乙醚、去氧胆酸钠和常用消毒剂及紫外线照射等迅速灭活。目前已在河南、湖北、山东、安徽、辽宁、江苏等省发现该病病例,主要分布在以上省份的山区和丘陵地带的农村,呈高度散发。本病多发于春、夏季,不同地区可能略有差异。人群普遍易感,在丘陵、山地、森林等地区生活、生产的居民和劳动者以及赴该类地区户外活动的旅游者感染风险较高,传播途径尚不明确,部分病例有明确的蜱叮咬史。此外,有文献报道,接触危重病人急性期血液具有人传人的可能性,应引起患者家属和卫生工作者的重视,做好个人防护。布尼亚病毒在自然界的传播-循环的模式主要有两种：1、以La crosse病毒为例,其在自然界中主要传播媒介为蚊虫,主要扩增宿主为小型啮齿动物(松鼠、花栗鼠等),雌蚊可通过卵将病毒传播给下一代,这也是La crosse病毒过冬的主要机制；此外,通过交配的方式雄蚊可将病毒传播给雌蚊,引起在蚊种群中的扩散；感染的蚊虫通过叮咬小型啮齿动物,在动物体内引起病毒血症,其他蚊虫叮咬被感染的动物引起该病毒进一步扩散,感染的蚊虫叮咬人,可在人群中引起疾病。2、以汉坦病毒为例,该类病毒主要通过啮齿动物进行传播,主要有水平传播(撕咬、粪、尿和气溶胶),垂直传播(感染的雌鼠将病毒传播给子代),人接触感染性的粪、尿、气溶胶或被咬伤也可导致感染。除流行病学调查发现部分病例有蜱叮咬史之外,SFTS病毒在自然界的传播-循环模式尚不清楚。本研究中,采集疫区的媒介标本,以及动物血清,对标本中病毒RNA的含量、动物血清中的特异性抗体进行检测,从阳性标本中分离病毒,并进行全基因组序列测定。通过同源性比较、系统发育分析、病毒体外复制特性比较、抗原性比较等不同方面阐释蜱、羊和狗,作为该新型病毒媒介和宿主的可能性。此外,开展理化特性实验和药敏实验,以期对该新型病毒生物学特性有较全面的研究,为进一步开展相关工作提供基础资料。[研究目的]1.探索“发热伴血小板减少综合征病毒”在传播媒介及宿主中的流行情况；2.分析比较该病毒的病原学和分子生物学特征；3.了解该病毒的生物学特性,为开展相关研究奠定理论基础。[研究方法]1.采集疫区的蜱和家畜血清标本,通过实时荧光定量PCR和双抗体夹心法ELISA及间接免疫荧光法(IFA),检测媒介和动物血清中发热伴血小板减少综合征病毒RNA和动物血清中特异抗体；2.病毒RNA检测阳性的标本,采用细胞培养技术分离病毒,并通过间接免疫荧光实验进行鉴定；3.通过RT-PCR方法,对荧光定量PCR检测阳性标本和分离毒株进行序列测定,并进行同源性比较和系统发育分析；4.通过生长动态实验,观察该病毒的复制特性,通过交叉中和实验和间接免疫荧光实验,比较不同标本中分离得到的病毒株的抗原特性差异；5.通过灭活实验,探索该病毒的灭活条件；6.开展理化特性研究,观察该病毒对不同理化因素的敏感性；7.通过药敏实验,观察利巴韦林对该病毒的体外抑制效果。[结果]1.标本采集和SFTS病毒核酸检测：共采集山东蓬莱、莱州2市22户病人及邻居家畜寄生蜱140头,主要采自牛、羊、狗三种动物,动物带蜱率100%(带蜱率=带蜱数／检查动物数)。经分类鉴定,所采蜱主要从属于3属3种,分别为血蜱属(长角血蜱、扇头蜱属血红扇头蜱以及革皮属森林革蜱,其中长角血蜱为优势蜱种,构成比为91.4%,森林革蜱和血红扇头蜱分别占5%、3.6%。对蜱研磨液进行多重荧光定量PCR结果显示,SFTS病毒核酸阳性3头,均为长角血蜱,其中2头采自病人家庭饲养的狗体表,1头采自羊体表。蜱最小感染率为2.14%(最小感染率=阳性组数／蜱总数×100%),蚊标本研磨液未检测到病毒RNA。共采集动物血液标本106份,其中牛血清21份、羊血清50份、狗血清35份,其病毒RNA阳性率分别为4.7%、6%、2.8%。2. SFTS病毒抗体检测：共采集动物血液标本106份,其中牛血清21份、羊血清50份、狗血清35份,ELISA检测的总抗体阳性率分别为0%、60%、19%,间接免疫荧光检测的抗体阳性率分别为0%、60%、19%。3.病毒分离及鉴定：SFTS病毒核酸检测阳性的标本,经连续三代细胞分离培养,通过SFTS病毒核酸检测和间接免疫荧光检测法鉴定,从采自山东莱州的蜱研磨液、狗血清以及羊血清中各分离到一株病毒。4.序列测定及比对分析：将从蜱研磨液、狗血清以及羊血清中分离的毒株,进行全序列测定,从蜱中分离的毒株的序列与病人血清中分离的毒株核酸序列S、M、L片段的同源性分别为94.9%-99.3%,95.2%-99.6%,95.9%-98.9%；从羊血清标本中分离的毒株与病人血清中分离的毒株核酸序列S、M、L片段的同源性分别为95.2%-100%,95.6%-98.1%,96%-98.1%；从狗血清标本中分离的毒株与病人病人血清中分离的毒株核酸S、M、L片段的同源性分别为94.8%-98.2%,95.9%-97.5%,95.9%-98.1%；通过系统发育分析,未发现各毒株之间有明显的联系,不同省份分离到的毒株聚为一类,没有明显的地域特征。5.病毒生长动态：通过观察该病毒的复制特性,未发现蜱源病毒株和人源病毒株的生长趋势有明显差别,第1-3天,病毒复制缓慢,第5-7天病毒进入对数生长期,第7-10天病毒达到生长平台期,病毒滴度可达3*107(TCID50/ml)。6.病毒抗原性比较：通过间接免疫荧光法和交叉中和试验检测,未发现从人、羊、狗、蜱不同标本分离的毒株与相同恢复期血清反应的抗体滴度有明显差异,均在4倍以内。这提示不同标本中分离的毒株在抗原性无明显差异。7. SFTS病毒生物学特性：通过理化特性分析,该病毒在60℃水浴30min、福尔马林(1：2000)、p-丙内酯(1：4000)条件下即可完全灭活,对热、乙醚、氯仿、紫外线、PH3、丙酮等理化因素敏感,并通过药敏实验发现利巴韦林能体外有效抑制病毒的复制。[结论]1.通过病毒RNA检测,发现该病毒核酸在蜱和动物血清中都有检出,并且病毒抗体在动物中有较高的阳性率,提示该病毒在当地环境中广泛存在。2.首次在长角血蜱、羊血清和狗血清中分离到病毒,从病原学上证实蜱和羊、狗做为该新型病毒传播媒介和宿主的可能性；在牛、羊、狗血清中均检测到该病毒的特异性抗体,从血清学上证实其作为宿主的可能性。3.将从长角血蜱、羊血清、狗血清和人血清中分离到毒株进行全序列测定,并进行同源性比较,不同标本分离的毒株在核酸水平和氨基酸水平上的同源性均在95%以上以上,且各毒株之间没有明显的地域特征。4.通过病毒体外复制动态试验、交叉中和试验和间接免疫荧光试验证明,从长角血蜱、羊血清、狗血清和人血清中分离的毒株在生长特性和抗原性上无明显差异。5.通过理化实验和药敏实验,为研究该病毒灭活疫苗和防治提供基础资料。