前言:　　 肿瘤的发生是由一系列复杂的生物学过程引起，有多种因素参与作用，除了有癌基因的激活和抑癌基因的灭活外，细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控也是肿瘤发生发展的重要途径。而随着现代分子生物学、生物化学理论及科研技术的进步，人们对细胞癌变以及肿瘤的形成有了更新的认识。　　 外阴癌是少见的妇科恶性肿瘤之一，其中以外阴鳞状细胞癌(vulvar squamouscell carcinoma，VSCC)最为常见，约占外阴恶性肿瘤的80-90％，占妇女全身肿瘤的1-2％，近年发病率较为平稳，但是外阴上皮内瘤样病变(vulvar intra-epithelialneoplasia，VIN)的发病率逐年上升。两者在分子水平上是否有相同的变化，目前尚不清楚。　　 转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一类多功能的多肽类生长因子，通常认为，TGF-β抑制细胞增殖的重要机制是对细胞周期的阻滞作用，主要通过对细胞周期素(cyclin)，细胞周期素依赖激酶(CDK)，细胞周期素依赖激酶抑制因子（CDK inhibitor，CKI）以及c-myc癌基因的表达水平及功能状态进行调控，使pRb去磷酸化而活化，活化的pRb结合并抑制大量生长因子，导致细胞停滞在G1期。p15基因是近年研究发现的多种肿瘤抑制基因(multipletumor suppressor，MTS)，属于CKIs中的INK4家族。在细胞周期中是重要的负调控因子，阻止细胞进入S期，起着抑制细胞增殖、促进细胞分化作用，故其在肿瘤的发生发展过程中可能起到重要的作用。许多看家基因和原癌基因的启动子区存在sp1结合位点，sp1转录因子与它的同源结合位点结合后能够活化基因转录，有研究发现TGF-β对p15的诱导发生在转录水平，作用位点在p15启动子-110bp～-30bp一段富含GC的序列上，p15转录起始位点上游存在三个sp1结合位点，其中第二个是最关键的，在TGF-β的信号作用下，该位点能够与转录因子sp1、sp3结合，活化p15的转录。　　 目前TGF-β1和p15与外阴肿瘤病变发生发展的关系尚不清楚。本研究拟采用 realtime PCR及免疫组化方法研究TGF-β1和p15基因在外阴鳞癌、外阴上皮内瘤样病变及正常外阴皮肤中的表达，探讨它们与外阴癌变之间的关系。　　 材料与方法:　　 一、实验对象　　 在知情同意的情况下，收集2005年8月～2012年4月在中国医科大学附属盛京医院、中国医科大学附属第一医院及辽宁省肿瘤医院住院或门诊就诊进行外阴活检或手术切除的①外阴鳞癌患者癌组织标本60例;②外阴上皮内瘤样病变标本60例;③对照组选取正常外阴皮肤标本10例。所有获取的新鲜标本离体后经生理盐水冲洗干净，一部分10min内置于液氮罐内迅速冷冻后置-80℃保存待realtime PCR实验，另一部分均用10％福尔马林溶液浸泡固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，经由两位资深病理科医生盲目法阅片且取得一致结果待免疫组化实验。　　 二、实验试剂及仪器　　 即用型兔抗人TGF-β1、p15单克隆抗体购自santa公司、β-actin引物购自广州锐博公司，RNAiso Plus试剂（TaKaRa货号:D9108B）、反转录试剂盒(TaKaRa货号:DRR037A)、real-time PCR试剂盒（TaKaRa货号:DRR081）、无RNA酶水（Thermo货号:SH30538.02）购自宝生物工程（大连）有限公司，EliVisionTM plus试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司，ABI7900HT realtime PCR来自美国ABI公司，realtime PCR96孔板购自AXYGEN公司，氯仿、75％乙醇、苏木素、盐酸、过氧化氢等试剂由中国医科大学附属盛京医院实验室提供。　　 三、实验方法　　 (一) Realtime PCR　　 1、细胞提取RNA　　 取-80℃保存标本样品用液氮研磨法将组织磨成粉末，加入1ml的RNAisoPlus裂解细胞，充分溶解5min转移到EP管中，4℃、12，000rpm离心15min，吸上清室温静置5min，加200μl氯仿，充分乳化后室温静置5min，4℃、14，000rpm离心15min，将上清移入新离心管，加500μl异丙醇上下颠倒混匀，室温静置10min,4℃、14,000rpm离心10min，弃去液体，沉淀用75％乙醇（DEPC水配置）洗涤，4℃、7,500rpm离心5min，弃上清，沉淀于超净台通风吹干，将沉淀完全置于30μlRNase Free dH2O，紫外分光光度计测定RNA的含量。样品置于-70℃长期保存。　　 2、反转录（10ul体系）　　 配置反应液的所有操作均在冰上进行，严格按照PrimeScript(R)RT reagent KitPerfect realtime(200次量)说明书操作。利用设计的引物和试剂盒中的试剂，将样品RNA反转录成cDNA。反应体系为10μl:Total RNA1.0μl,5×PrimeScriptTMBuffer(for Real Time)2.0μl, PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I0.5μl,Oligo dT Primer(50μM)0.5μl, Random6 mers(100μM)0.5μl, RNase Free dH205.5μl。反应条件为:37℃15 min进行反转录，80℃5 sec使反转录酶失活，结束反应，4℃冷却。-20℃长期保存。　　 3、 realtime-染料法(20ul体系)　　 以β-actin作为内参照，使用SYBR(R) Premix Ex TaqTM(Perfect Realtime)进行反应，反应体系为20μl: cDNA5.0μl，上游引物(20μM)1.0μl，下游引物(20μM)1.0μl, Master SYRB Green Mix(5×)4.0μl, ddH2O9.0μl。反应体系加入光学96孔板，加盖光学封口膜，离心后放入ABI7900HT realtime PCR仪，反应以下条件:Stage1:预变性:95℃,30sec; Stage2: PCR反应Reps:40cycle,95℃5sec,60℃30sec。实验重复3次，分析PCR反应曲线，计算2-△△Ct值并用sigmaplot作柱状图。PCR引物序列如下:TGF-β1:5-AACCCACAACGAAATCTATGACAA-3(forward),and5-AGAGCAACACGGGTTCAGGTA-3(reverse);p15:5-CGCCCACAACGACTTTATTTTC-3(forward),5-TTGGCAGCCTTCATCGAATTA-3(reverse);β-actin:5-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3(forward),and5-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3(reverse)。　　 （二）免疫组化　　 1、EliVisionTM plus法　　 4μ石蜡切片常规脱蜡，梯度水化后，用PBS(PH7.4)冲洗三次，每次3min。每张切片加1滴过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复。PBS冲洗3次，每次3min。甩去PBS液，每张切片加50μl的第一抗体（兔抗人TGF-β1单克隆抗体或兔抗人p15单克隆抗体），室温下孵育90min或4℃过夜。PBS冲洗3次，每次5min。甩去PBS液，每张切片加50μl聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20min，PBS冲洗3次，每次3min。甩去PBS液，每张切片加50μl酶标抗兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min，PBS冲洗3次，每次3min。甩去PBS液，每张切片加100μ1新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10min，阳性显色为棕色。自来水冲洗10min，苏木素复染2min，0.1％盐酸分化，自来水冲洗15min，PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明8min，中性树胶封固封片。　　 2、结果判断　　 TGF-β1阳性细胞的着色主要表达在细胞核。p15阳性染色定位于细胞核和（或）细胞浆，以出现清晰的黄棕褐色颗粒判定为阳性。每例标本先在低倍镜下随机观察5个高倍视野，计数100个细胞中出现的阳性细胞的比值，取其均值为细胞阳性指数（LI=染色阳性细胞数/肿瘤细胞数×100％）。①根据阳性细胞所占百分率分为4级:1级0％～5％，2级6％～25％，3级26％～50％，4级≥50％。②根据胞浆的着色程度分为:0级:阴性;1级:弱阳性;2级:中等阳性;3级:强阳性。将①、②级数之和判断结果，0～2为“-”，3～4“+”，5～6为“++”。以+～++判断为阳性表达。　　 （三）统计学处理　　 各组之间比较、不同的临床分期、组织细胞分化程度、组织类型的TGF-β1的表达比较利用SPSS19.0系统，通过X2(Chi-Square)检验，连续矫正检验及t检验。P＜0.05有统计学意义。　　 结果:　　 一、realtime PCR方法检测TGF-β1和p15在外阴病变组织中的表达。　　 经realtime PCR检测发现，TGF-β1和p15在正常外阴组织中高表达，随着病变程度的加深表达逐渐减少。TGF-β1在正常组织中的相对表达量为(1.147±0.082)，在外阴上皮内瘤样病变中的相对表达量为(0.854±0.046)，在外阴鳞状细胞癌中的相对表达量(0.511±0.033)，正常组织中的表达量明显高于在外阴上皮内瘤样病变及外阴鳞状细胞癌中的表达量，且差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 p15在正常组织中的相对表达量为(7.808±0.248)，在外阴上皮内瘤样病变中的相对表达量为(6.398±0.125)，在外阴鳞状细胞癌中的相对表达量(3.326±0.289)。正常组织中的表达量明显高于在外阴上皮内瘤样病变及外阴鳞状细胞癌中的表达量，三组数据统计，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 二、免疫组化实验结果　　 （一）TGF-β1在外阴病变组织中的表达情况　　 TGF-β1阳性定位于细胞核，呈棕黄色颗粒，在正常鳞状上皮中阳性细胞主要分布在基底细胞层。　　 TGF-β1在正常的外阴皮肤中阳性表达率为100％，在外阴上皮内瘤样病变和外阴鳞状细胞癌中的阳性率分别为40％、56.7％。正常外阴皮肤组的TGF-β1表达阳性率高于外阴上皮内瘤样病变组及外阴鳞状细胞癌组，且与两者相比有显著差异(P＜0.05)。外阴上皮内瘤样病变组及外阴鳞状细胞癌组中TGF-β1表达的阳性率无显著差异(P＞0.05)。　　 根据肿瘤临床分期，TGF-β1在Ⅰ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为60％，Ⅱ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为61.1％，Ⅲ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为50％，Ⅳ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为0％。虽然随着临床分期的不断加重TGF-β1表达的阳性率逐渐下降，但各组无显著统计学差异(P＞0.05)。　　 根据组织学类型，TGF-β1在高分化外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为64.7％，在中分化外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为57.1％，在低分化外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为33.3％。随着组织分化类型逐渐减低TGF-β1表达的阳性率逐渐下降，但各组无显著统计学差异(P＞0.05)。　　 （二）p15在外阴病变组织中的表达情况　　 p15阳性主要定位于细胞核，同时肿瘤细胞的胞浆也有表达。　　 p15在正常的外阴皮肤中阳性表达率为100％，在外阴上皮内瘤样病变和外阴鳞状细胞癌中的阳性率分别为63.3％、53.3％。正常外阴皮肤组的p15表达阳性率高于外阴上皮内瘤样病变组及外阴鳞状细胞癌组，且与外阴鳞状细胞癌组相比有显著差异(P＜0.05)。外阴上皮内瘤样病变组及外阴鳞状细胞癌组中p15表达的阳性率亦无显著差异(P＞0.05)。　　 根据肿瘤临床分期，p15在Ⅰ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为100％，Ⅱ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为55.6％，Ⅲ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为16.7％，Ⅳ期外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为0％。虽然随着临床分期的不断加重p15表达的阳性率逐渐下降，但各组无显著统计学差异(P＞0.05)。　　 根据组织学类型，p15在高分化外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为47.1％，在中分化外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为57.1％，在低分化外阴鳞状细胞癌中的表达阳性率为66.7％。随着组织分化类型逐渐减低p15表达的阳性率逐渐上升，但各组无显著统计学差异(P＞0.05)。　　 （三）TGF-β1与p15在外阴鳞状细胞癌组织中表达的相关性　　 TGF-β1阳性、p15阴性与TGF-β1阴性、p15阳性的样本共14例(23.3％)，与两种因子同时阴性(33.3％)和同时阳性(43.3％)相比，前者明显低于后者(P＜0.05)，且γ＞0提示两者表达可能有正相关性。　　 结论:　　 1.TGF-β1的表达可能与外阴癌变的过程有关，与外阴鳞状细胞癌的临床分期和病理类型无关。　　 2.p15的表达缺失可能与外阴鳞状细胞癌的发生有关。　　 3.TGF-β1和p15在外阴鳞状细胞癌组织中的表达具有正相关性，提示在外阴癌发生过程中二者可能具有协同性抑制作用。