论文部分内容阅读
目的:细菌性脑膜炎是常见的致死性感染性疾病。肺炎链球菌是一种革兰氏阳性的细胞外病原体,是目前细菌性脑膜炎在世界范围内最常见的病原体,主要影响儿童和老年人。虽然肺炎链球菌更常见于鼻咽部的静态定植,但除了引起轻度感染如中耳炎和鼻窦炎,感染加重时也会突破血脑屏障形成脑膜炎危及生命。肺炎链球菌脑膜炎死亡率高达20~30%,且幸存者大部分患有不同程度的神经后遗症。目前肺炎链球菌脑膜炎的预防主要依赖于疫苗,当前的多糖结合疫苗在降低由疫苗类型菌株引起的侵袭性肺炎链球菌疾病的发病率方面非常有效。然而,由此引发的血清型替代导致这些疫苗的有效性已经有所下降。由此,研发不依赖血清型的新型疫苗十分重要。课题组先前研究表明融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply能够抵抗多种肺炎链球菌导致的致死性感染疾病,具有开发价值,但它对脑膜炎是否有保护效果尚不清楚。PGRN为一种神经营养因子,在先前研究中发现缺少PGRN的小鼠脑膜炎症状更严重,提示PGRN可能对脑膜炎具有保护作用和治疗潜能,但PGRN保护肺炎链球菌脑膜炎小鼠的机制未知。因此,本研究将探索融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply是否对肺炎链球菌脑膜炎有保护作用,以及PGRN保护肺炎链球菌脑膜炎小鼠的机制,为肺炎链球菌脑膜炎提供新的预防和治疗策略。方法:建立实验室脑膜炎小鼠模型:使用脑立体定位仪以侧脑室注射法,向小鼠脑内缓慢注射15μLⅢ型肺炎链球菌悬液,菌量5×10~6CFU/只;主动免疫后的小鼠通过尾侧静脉注射100μL Tigr4悬液,菌量5×10~8CFU/只。被动免疫抗血清:分别将浓缩抗DnaJ-△A146Ply血清和对照血清经侧脑室注入实验组和对照组小鼠脑内,浓缩血清体积5μL,随后立即使用肺炎链球菌Ⅲ型和Tigr4经侧脑室注射构建脑膜炎模型,Ⅲ型注射菌量为5×10~6CFU/只,Tigr4为1×10~8CFU/只,共10μL。DnaJ-ΔA146Ply对肺炎链球菌脑膜炎保护效果评价探索:主动免疫或被动免疫后的小鼠经肺炎链球菌感染后,观察24小时脑部菌载量、炎性因子表达及炎症浸润情况。PGRN对肺炎链球菌脑膜炎小鼠保护机制探索:使用小鼠小胶质瘤细胞BV-2细胞建立细胞模型并通过Western blot检测焦亡情况;挑选年龄、体重一致的C57/BL6 WT小鼠和pgrn-/-小鼠,使用肺炎链球菌血清型Ⅲ型通过侧脑室注射法建立脑膜炎模型。采用Western blot检测脑膜炎小鼠脑中NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD,IL-1β,IL-18表达情况,并使用炎性小体抑制剂MCC950进行逆向验证。结果:主动免疫融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply 3次后抗体效价达到10~6,可用于收集血清及后续主动免疫实验。侧脑室被动免疫注射抗DnaJ-ΔA146Ply血清并进行肺炎链球菌血清型Ⅲ型及Tigr4构建脑膜炎模型,建模24小时后计数菌载量,结果显示注射抗DnaJ-ΔA146Ply血清的脑膜炎小鼠脑组织中细菌载量较注射对照血清组的显著降低(Ⅲ型感染组p<0.05,Tigr4感染组p<0.01)。通过ELISA检测脑匀浆上清,结果发现注射抗DnaJ-ΔA146Ply血清的脑膜炎小鼠脑中TNF-α、IFN-γ表达量较注射对照血清组显著下调(p<0.05)。脑组织切片HE染色结果显示,与注射对照血清组相比,注射抗DnaJ-ΔA146Ply血清的脑膜炎小鼠侧脑室及软脑膜炎症细胞浸润情况较轻。皮下主动免疫DnaJ-ΔA146Ply三次的C57/BL6小鼠,经尾静脉注射100μL 5×10~8CFU肺炎链球菌血清型Tigr4,24小时脑组织菌载量计数结果显示,其菌载量较PBS对照免疫组显著降低(p<0.05)。使用BV-2小胶质细胞建立细胞模型,经肺炎链球菌血清型Ⅲ型处理6小时后,BV-2细胞发生肿胀变形,培养上清LDH表达增高。Western blot结果显示,经细菌处理的BV-2细胞NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18表达显著增高(p<0.05)。Pgrn-/-小鼠通过侧脑室注射5×10~6CFU肺炎链球菌Ⅲ型,24小时后,脑匀浆上清LDH释放较野生鼠增加。通过Western blot检测对照组与脑膜炎组小鼠脑组织蛋白表达情况,结果发现,脑膜炎小鼠脑中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18表达增高(p<0.05),且pgrn-/-脑膜炎小鼠表达量高于WT脑膜炎小鼠(p<0.05)。Pgrn-/-小鼠预先24小时腹腔注射MCC950,再通过侧脑室注射肺炎链球菌血清型Ⅲ型建立脑膜炎模型后,24小时脑部菌载量结果显示,MCC950预处理的脑膜炎小鼠菌载量较野生鼠有降低的趋势。结论:融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply对多种血清型肺炎链球菌导致的小鼠脑膜炎感染具有保护作用,能够降低脑部细菌侵袭和炎性浸润情况。肺炎链球菌脑膜炎小鼠脑中发生了细胞焦亡,pgrn-/-鼠焦亡情况更重,MCC950抑制炎性小体,能够降低肺炎链球菌在脑部定植。提示PGRN在肺炎链球菌脑膜炎中可能通过对抗焦亡而发挥保护作用,这为肺炎链球菌脑膜炎的治疗提供了新的思路。