卤代苯醌类消毒副产物对斑马鱼胚胎的毒性效应研究

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饮用水消毒过程中产生的卤代苯醌类(HBQs)副产物,因其浓度低、毒性高已引起了人们高度关注。离体研究表明,HBQs可诱导膀胱癌细胞的氧化应激效应;还能使人类神经干细胞(h NSC)的细胞增殖受到抑制,表现出潜在神经毒性。然而对这类新型消毒副产物的毒理学效应研究目前还停留在离体细胞层次上,其在活体里的毒性效应还需进一步研究。本文以斑马鱼胚胎为模式生物,探索HBQs对斑马鱼胚胎的毒性效应,包括发育毒性、氧化应激效应、神经毒性和心血管毒性。首先,研究了HBQs对斑马鱼胚胎的氧化应激效应,用5种卤代苯醌在不同浓度下暴露受精后4小时(4 hpf)的斑马鱼胚胎,分别在不同的发育阶段评估毒性效应。主要研究内容包括对不同暴露时间死亡率、畸形率、孵化率的统计,得出LC50。并测定了胚胎氧化还原系统中相关因子,观察了不同发育时期的形态学;同时通过HBQs与抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的复合暴露实验,观察HBQs暴露导致的异常发育是否有所缓解。结果表明,死亡率、孵化率和畸形率皆与HBQs暴露浓度正相关,加了NAC复合暴露组的死亡率、畸形率、孵化率显著性降低;HBQs暴露至96 hpf时,通过吖啶橙(AO)染色实验,发现高剂量暴露下幼鱼体内有较多细胞发生凋亡;HBQs暴露至120 hpf时,测定了幼鱼体内相关氧化还原产物包括活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、8-羟基尿苷(8-OHd G),同时还做了胚胎DNA Ladder实验和凋亡相关基因的q RT-PCR,结果表明ROS含量具有暴露浓度依赖性,SOD、GSH和8-OHd G含量随暴露浓度增高而降低,且在高浓度暴露组DNA碎片较多,凋亡相关基因mdm2相对表达量有所降低,而p53基因相对表达量有上调的趋势;最后用传统消毒副产物卤乙酸(HAAs)包括:二溴乙酸(DBH)、二氯乙酸(DCH)、碘乙酸(IAA)暴露斑马鱼胚胎,结果发现新型消毒副产物HBQs的LC50比HAA的LC50要小200倍有余。这些研究结果表明HBQs具有显著的胚胎发育毒性,以及可以诱导强烈的氧化应激效应。其次,研究了HBQs暴露对斑马鱼的神经毒性。我们选取了三种HBQs分别是2,5-DCBQ,2,5-DBBQ以及2,6-DCBQ,每种暴露药物有三个浓度分别是0.5、2.5、5.0μM(DMSO含量不超过0.07%);对照组为0.065%DMSO。斑马鱼胚胎自受精4小时后(4 hpf)暴露至120 hpf后,通过斑马鱼行为分析仪和Ethovision软件对幼鱼的运动神经系统做出整体的评估,结果表明高剂量暴露组的运动行为能力减弱;其次通过分子生物学实验,测定幼鱼体内相关神经递质的含量,例如:多巴胺、γ-氨基丁酸等,同时测定了乙酰胆碱酶的活力,结果表明这些神经递质含量均有下调的趋势;除此之外,用q RT-PCR测定了神经调节相关基因(gfap、mbp、syn-2a以及α1-tubulin)的相对表达量;通过整体原位杂交实验观察神经系统调节基因gfap的原位表达,结果显示神经调节相关基因表达量减少;最后对暴露组的活性蛋白进行蛋白质组学分析,结果发现有较多差异蛋白富集在神经发育相关的通路上。以上结果表明HBQs对斑马鱼胚胎具有神经毒性。最后,选取2,6二氯-1,4-对苯醌(2,6-DCBQ)暴露斑马鱼胚胎,基于转录组学分析方法研究2,6-DCBQ对斑马鱼胚胎的心血管毒性效应。依据前文研究结果对暴露剂量进行了优化,分别选取了0、2、4、8μM 4个浓度,通过转录组分析得到显著差异表达基因,并对这些差异基因进行功能聚类分析和通路富集分析,结果表明有较多的差异基因聚类在氧化应激反应、神经发育系统以及心血管系统相关的功能上;此外我们还借助两种转基因斑马鱼(Tg(kdrl:EGFP)血管具有荧光标记和Tg(zp3:fsta,myl7:EGFP)心脏具有荧光标记),通过荧光显微镜对暴露后的转基因斑马鱼心脏以及血管发育进行形态学观察,发现斑马鱼心脏发育异常,主要表现为心包水肿以及心房心室的分离,且在高浓度暴露组斑马鱼幼鱼下颌血管支流的数量显著减少,证实了2,6-DCBQ对斑马鱼具有心脏发育毒性;与此同时,用Danioscope软件对幼鱼的血流量活力进行分析,结果发现在8μM暴露剂量下血流活力显著降低;最后通过原位杂交技术,观察药物暴露后对心脏特异性标记基因myl7原位表达情况,结果发现myl7基因的表达随着暴露浓度的上升而受到抑制。研究结果说明了HBQs对斑马鱼胚胎具有心血管毒性。总之,对新型消毒副产物HBQs的活体毒性效应研究表明,其具有氧化应激效应、神经毒性和心血管毒性。研究结果分子水平和整体水平上阐述了HBQs的环境毒理学效应,同时也具有应用价值,可为自来水厂饮用水安全管理部门制定合理的规范条文提供科学依据,科学评估这类新型消毒副产物对人体的潜在健康危害,最终为饮用水安全管理提供了科学依据。
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