研究背景：肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是原发肝癌中发病率最高的一种，高达90%以上，恶性程度高，预后极差。由于病情隐匿，发现时已经晚期，病情恶化，而现阶段针对晚期肝癌的主要治疗手段是手术切除或者重者进行肝脏移植。随着科技的不断进步，人们对肝癌的认识从宏观到微观，人们逐渐以基因的角度看待HCC，HCC的发病和病情进展是由不同的癌基因和抑癌基因相互作用促进病情的发展，所以抑制HCC的发展，可以通过下调相关活跃的癌基因得以实现。信号转导子和转录活化子3基因（Signal transducer andactivator of transcription3，Stat3）目前被定义为癌基因，据报道，Stat3在肝癌是呈过度表达状态，Stat3信号转导通路参与细胞增殖、分化以及凋亡等过程；该信号通路接收细胞的刺激信号例如生长因子等，并作用于胞核内特异性DNA片段，调控转录过程，从而呈持续激活状态，导致细胞恶性转化[1]。近来，通过抑制肿瘤中Stat3的表达从而达到抑瘤效果成为研究热点，通过RNAi策略即可实现以Stat3为治疗肝癌的靶点。实验室在前期工作中，成功构建Stat3特异的siRNA的质粒，抑制肝癌和前列腺肿瘤中Stat3的表达，但不能完全阻断Stat3的表达。红外线光热疗法具有无副作用和损伤肿瘤细胞作用，可以利用这一特点，可以作为一种辅助方式与基因治疗联合达到抑制肿瘤生长的目的。为了实现将Stat3特异性siRNA质粒（si-Stat3）运载到肿瘤细胞内发挥相应的抑癌作用，需要安全高效的基因运载体。近年来，一种高分子材料-氧化石墨烯备受关注，因为其拥有独特的电学、力学和热学等理化性质。氧化石墨烯经过表面修饰以后可以运载基因并提高基因的转染效率。聚乙烯亚胺（polythyleneimine, PEI）是一种阳离子基因传递的载体，与基因有很强的结合能力并能保护基因免遭核酸酶降解，同时还具有逃逸内涵体的能力。聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）可以提高GO-PEI的溶解性与稳定性，同时可以延长整个复合物在体内的循环时间。叶酸分子（folic acid，FA），实现整个复合物的靶向运载，运载Stat3特异性siRNA质粒到达肿瘤处，以便发挥基因抑制肿瘤生长的作用，降低副作用。由于复合物中的PEI含量不同，整个载体对基因的结合能力、运载能力有显著影响。根据GO与PEI的比重不同，PEI含量越高载体的结合能力越强，但PEI本身具有一定毒性，所以并非含量越高越好，故本实验探讨并采用了GO与PEI的最佳比例，作为Stat3特异性siRNA的基因运载体。叶酸受体（Folate receptors，FRS）分子量为38-44kDa。其中，叶酸受体都锚定在细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇域，生理条件下，叶酸受体在肾脏近曲小管上皮细胞的表达，呈高度保守状态。叶酸受体在卵巢癌，子宫内膜癌，脑，肺，肾细胞癌和肝癌中均呈高表达状态。据报道，叶酸受体在肿瘤高表达状态对肿瘤的预后具有重要价值，已被发现与患者生存率息息相关。利用这种表达差异性，叶酸可以作为治疗肿瘤过程中实现靶向性治疗肿瘤的作用。本实验采用GO-PEI-PEG-FA复合物作为Stat3特异性siRNA的基因运载体，将其靶向运载到肿瘤部位，同时利用氧化石墨烯可以吸收红外线这一特性，将红外线照射作为一种辅助联合治疗手段，从而达到抑制小鼠肝癌的生长，并初步探讨相关机制。目的：采用新型氧化石墨烯纳米粒子运载Stat3特异性siRNA质粒，通过叶酸实现靶向性，体内外实验证实抑制小鼠肝癌的生长，并初步探讨相关机制。方法：1、利用化学和生物学方法表征GO-PEI-PEG-FA基因载体，根据GO与PEI的比重不同，通过紫外光谱仪（UV）和原子力显微镜（AFM）等方法，表征和比较复合物的合成情况、表面电势等；观察不同比重的GO与PEI的GO-PEI-PEG-FA基因载体分别在生理盐水、PBS、培养液和血清中的稳定性比较；1%琼脂糖凝胶电泳检测与不同比重的GO-PEI-PEG-FA基因载体与si-Stat3的结合能力。MTT法检测不同比重的GO-PEI-PEG-FA对人源性肝癌细胞SMMC-7721细胞的毒性作用。2、体外实验，流式细胞术检测GO-PEI-PEG-FA基因载体携带si-Stat3在H22细胞中的转染效率。流式细胞术检测GO-PEI-PEG-FA携带si-Stat3对H22肝癌细胞凋亡的影响。Westernblot和半定量RT-PCR检测H22细胞中Stat3的蛋白以及下游基因表达水平。3、体内实验，HE染色观察GO-PEI-PEG-FA的安全性；观察小鼠体重、瘤重和体积、腹水情况和生存期。免疫组织化学观察增殖标志物PCNA的表达情况。流式细胞术检测GO-PEI-PEG-FA携带si-Stat3对肝原位癌凋亡的影响，TUNEL法检测原位肝癌的凋亡情况。Western blot和半定量RT-PCR检测肝原位癌中Stat3的蛋白以及下游基因表达水平。结果：1、成功合成GO与不同重量PEI之比的GO-PEI-PEG-FA基因载体（GO：PEI分别为1:10,1:20，1:40,1:60,1:80和1:100），六种复合物的表面电势的波动范围在+40.2mV-+52.1mV之间；动态散射光可以反应GO-PEI-PEG-FA的粒径尺寸波动范围为442nm-223nm。MTT法和转染效率结果显示最适合的GO与PEI的比例为1:80。所对应的GO-PEI-PEG-FA基因载体在PBS、生理盐水、培养液以及血清中的稳定和分散性良好，其良好的理化性质为复合物作为基因运载体提供良好的保障。2、体外实验结果，通过观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达情况，GO-PEI-PEG-FA复合物可以作为有效基因运载体，携带质粒si-Stat3靶向转染SMMC-7721细胞和H22细胞。半定量RT-PCR和Western blot结果显示，Stat3基因和蛋白水平表达明显低于对照组。CCK8结果显示，GO-FA-si-Stat3组增殖抑制率明显较高；流式结果显示，GO-FA-si-Stat3组细胞凋亡率明显高于其它组。3、体内实验表明，GO-PEI-PEG-FA携带质粒si-Stat3联合红外线治疗（简称GO-FA-si-Stat3+）靶向治疗组的小鼠生存期明显延长，肿瘤体积和重量明显小于其它组，腹水率明显低于其他组，具有统计学意义。半定量RT-PCR和Western blot结果显示，与其他组别相比，GO-FA-si-Stat3组中，Stat3的mRNA和蛋白表达水平明显下调，具有统计学意义。免疫组织化学结果显示，GO-FA-si-Stat3组能够显著抑制肿瘤增殖的相关标志物PCNA的表达。流式结果显示，GO-FA-si-Stat3+组细胞凋亡率明显高于其它组，同时Stat3下游基因和相关蛋白表达受到明显抑制。HE染色未发现心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺形态发生异常。结论：经叶酸修饰氧化石墨烯纳米粒子是安全并且有效的靶向基因运载工具，携带Stat3特异性siRNA质粒靶向进入肝癌细胞内发挥抑制肝癌生长的作用。利用氧化石墨烯能够吸收红外线的性质，联合红外线照射这一辅助手段能够进一步加强疗效。