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背景与目的:脑血管病是对人类健康极具威胁的常见病,是目前人类三大致死率最高的疾病之一,而缺血性脑血管病是其主要类型。脑组织缺血将会导致脑组织损害,而脑缺血后再灌注过程往往加重这一损害。自噬(autophagy)是真核细胞中一种高度保守的,形成囊泡并与溶酶体结合后降解长效蛋白、受损蛋白及受损细胞器,为细胞的代谢、发育提供养分和能量,维持细胞内稳态的过程。大量研究发现,脑缺血再灌注可诱发细胞自噬,且自噬过程基本发生于神经元,主要与饥饿、生长因子缺乏、病原体感染等有关,是脑缺血再灌注损伤的重要环节,此过程受一系列复杂的信号分子调控,其中Beclin1分子是自噬调控通路中最主要的分子之一,其与PIK3C3结合形成Beclin1-PIK3C3复合物,广泛参与自噬体的形成与成熟。不少研究者发现,其目的蛋白通过作用于Beclin1-PIK3C3复合物影响自噬过程,此过程称为“Beclin1依赖性自噬”,而部分研究者发现其目的蛋白不通过Beclin1作用影响自噬,此过程称为“Beclin1非依赖性自噬”。近年来有研究发现脑缺血再灌注损伤后可导致的神经元自噬过程,而Beclin1非依赖性自噬与促进凋亡水平、抑制脑功能恢复有关。因此,自噬可能成为未来治疗脑缺血性疾病的重要靶点。排斥导向分子a(Repulsive guidance molecule a,RGMa)是一种排斥性轴突导向分子,大量研究发现,脑缺血再灌注后RGMa表达增多,正是由于RGMa等一系列轴突生长抑制因子的存在,使得中枢神经系统(CNS)损伤后神经元修复及神经功能恢复极为困难。我们之前的研究发现,在大鼠脑缺血损伤后干预RGMa表达,可显著改善缺血再灌注脑损伤轴突的生长情况并有效促进神经功能恢复。6FNIII为RGMa受体neogenin分子中6个纤维蛋白Ⅲ样结构域,外源性6FNIII在体内可以和RGMa分子结合而抑制其生物学作用的发挥。本实验利用6FNIII对RGMa/Neogenin通路进行干预以及重组腺病毒抑制RGMa蛋白表达两种干预手段探讨RGMa对大鼠大脑皮质神经元缺血再灌注急性期引发的自噬以及神经功能恢复情况的影响,同时对RGMa影响自噬的机制作初步探索。方法:1.将30只雄性成年SD大鼠随机分为5组:假手术组(sham)、脑缺血再灌注组(I/R)、脑缺血再灌注加低浓度6FNIII干预组(I/R+L-6FNIII)、脑缺血再灌注加中浓度6FNIII干预组(I/R+M-6FNIII)、脑缺血再灌注加高浓度6FNIII干预组(I/R+H-6FNIII),立体定位侧脑室注射等体积不同浓度6FNⅢ后立即建立大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,所有组于再灌注后24h,采用Western-blot检测RGMa下游分子CRMP-2蛋白表达水平,确定最佳6FNIII干预浓度。2.将108只雄性成年SD大鼠随机分成6组:假手术组(sham)、脑缺血再灌注组(I/R)、脑缺血再灌注加生理盐水注射组(I/R+NS)、脑缺血再灌注加6FNIII干预组(I/R+6FNIII)、脑缺血再灌注加空载体腺病毒注射组(I/R+r Ad-HK)及脑缺血再灌注加RGMa重组腺病毒干预组(I/R+r Ad-sh RGMa)。6FNIII干预组及NS注射组于6FNIII或NS侧脑室注射后立即建立MCAO模型,腺病毒干预组于RGMa病毒大脑皮质注射后3天建立MCAO模型,所有组于再灌注后24h,采用Western blot检测脑组织自噬相关蛋白LC3II/I表达水平;免疫荧光双标观察LC3与神经元的共表达情况;透射电镜观察自噬体的形成情况;神经功能缺损评分估计神经功能恢复情况,TTC染色法检测脑梗死体积。然后采用Co-IP检测RGMa干预后Beclin1与PIK3C3结合有无改变;Co-IP检测缺血再灌注后RGMa是否与Beclin1或PIK3C3结合。结果:1.大鼠脑缺血再灌注后24h,I/R组、I/R+NS组及I/R+r Ad-HK组较sham组自噬相关蛋白LC3II/I水平升高(P<0.05)、自噬体形成增多、脑梗死体积扩大(P<0.05)、神经功能评分降低(P<0.05)、;I/R+6FNIII组较I/R组、I/R+NS组自噬相关蛋白LC3II/I水平降低(P<0.05)、自噬体形成减少、脑梗死体积缩小(P<0.05)、神经功能评分增高(P<0.05);I/R+r Ad-sh RGMa组较I/R组、I/R+NS组、I/R+r Ad-HK组自噬相关蛋白LC3II/I水平降低(P<0.05)、自噬体形成减少、脑梗死体积缩小(P<0.05)、神经功能评分增高(P<0.05);而I/R+NS组、I/R+r Ad-HK组较I/R组以上各项均无统计学意义(P>0.05)。2.大鼠脑缺血再灌注后24h,I/R组RGMa与Beclin1及PIK3C3均无结合;I/R+6FNIII组可见Beclin1与PIK3C3结合。结论:在缺血再灌注急性期,外源性6FNIII可有效抑制RGMa生物学作用的发挥。RGMa干预后自噬水平降低、促进神经功能恢复,提示脑梗死急性期RGMa可能通过促进自噬而参与抑制神经功能恢复的过程。缺血再灌注后RGMa与Beclin1及PIK3C3均无结合,RGMa干预后仍可见Beclin1与PIK3C3结合,提示脑梗死急性期RGMa可能通过Beclin1非依耐途径参与自噬的调控。