山核桃干腐病(Botryosphaeria dothidea)是浙江重要经济树种山核桃树的最主要病害,导致超过90%的山核桃树发病,对当地造成了巨大的经济损失。目前针对该病的防治还以戊唑醇和苯醚甲环唑等化学农药为主,尽管这些化学农药可以有效控制山核桃干腐病,但同时也存在增加真菌耐药性和环境污染等诸多问题,因此开发一个新的防治山核桃干腐病的植物源农药迫在眉睫。苦参碱是一种从苦参中提取的喹诺里西啶类生物碱,在防治植物真菌病害方面具有广阔的应用前景,然而由于苦参碱对植物病原真菌的抗真菌活性及其抗真菌机制尚不明确,阻碍了苦参碱制剂的开发和实际应用。鉴于此,本研究测定了苦参碱对山核桃干腐病病原菌的抗真菌活性,并进一步通过探讨苦参碱对真菌细胞膜、呼吸代谢和转录组的影响,阐述其作用机制,最后通过研究苦参碱对抗真菌农药的增效作用,筛选出具有田间应用潜力的组方,为苦参碱在林业上的应用和推广打下坚实理论基础。主要研究结果如下:1.采用菌丝体生长速率法测定了苦参碱对7种林业病原真菌的抑真菌活性,并以最敏感的山核桃干腐病病原菌为研究对象,进一步研究苦参碱对其孢子萌发和菌丝生长的抑制作用。结果显示:苦参碱对山核桃干腐病病原菌抑菌效果最好(IC50=1.512mg/mL),其次是杨树叶枯病病原菌、油茶炭疽病病原菌、樟子松枯梢病病原菌、梨树芽枝霉病原菌和樟子松黑点枯针病病原菌,对百合枯萎病病原菌抑菌活性最差。苦参碱对山核桃干腐孢子萌发和菌丝生长均具有抑制作用,且与浓度呈正相关。10.0mg/mL苦参碱可以在96天内可以完全抑制菌丝的生长。这些结果表明苦参碱可以有效抑制I山核桃干腐病病原真菌的菌丝生长和孢子萌发,具有广阔的市场前景。2.为了研究苦参碱对山核桃干腐病病原菌细胞膜的影响,首先通过倒置显微镜、扫描电镜和透射电镜观察苦参碱对山核桃干腐病病原菌菌丝形态和超微结构的影响,随后进一步测定了苦参碱处理前后真菌细胞膜通透性、MDA、活性氧含量和抗氧化酶活性的变化。结果显示:通过倒置显微镜、扫描电镜和透射电镜观察发现苦参碱处理后山核桃干腐病病原菌菌丝形态和超微结构变化显著,主要包括真菌菌丝发生皱缩,质壁分离和细胞质泄漏。同时试验结果发现苦参碱可以显著增加细胞外电导率和内容物释放量,并导致山核桃干腐病病原菌总脂质含量显著降低,表明苦参碱可以增加真菌细胞膜通透性。此外,苦参碱处理后,真菌菌丝体内MDA、活性氧含量和保护酶(SOD,CAT,POD)的活性显著增加,提示苦参碱可以导致真菌细胞膜发生脂质过氧化过程。结果表明:苦参碱可以通过脂质过氧化过程提高真菌细胞膜通透性,发挥菌丝生长抑制作用。3.为了测定苦参碱对山核桃干腐病病原菌呼吸代谢的影响,本研究采用呼吸代谢抑制试验分析苦参碱可能的呼吸抑制途径并测定了相关途径酶的活性变化,随后进一步分析了苦参碱对山核桃干腐病病原菌线粒体耗氧量和线粒体复合体Ⅰ、Ⅲ活性的影响及线粒体复合体I抑制剂鱼藤酮对苦参碱处理后真菌菌丝体内活性氧含量的影响。结果显示:苦参碱可以提高山核桃干腐病病原菌菌丝体内ATP含量和ATP酶活性,抑制糖酵解途径,增强三羧酸循环途径,提高线粒体耗氧量和复合酶I活性。同时鱼藤酮可以有效减少苦参碱处理后山核桃干腐病病原菌菌丝体内活性氧含量。结果表明:苦参碱会影响山核桃干腐病病原菌的呼吸代谢能力,并通过线粒体复合体I产生过量活性氧。4.为了从分子水平上探究苦参碱的作用机制,本试验分别构建了苦参碱低剂量处理组、高剂量处理组和对照组山核桃干腐病病原菌的转录组文库,并分析比较差异基因。结果表明:共获得58.65Gb Clean Data,Q30碱基百分比均不小于93.39%,过滤后获得36,806 条 Unigene,注释到 nr、Swiss-Prot、GO、COG、KOG 和 KEGG 数据库的基因数量分别为28077、8513、16739、13956条、9954和5667条。通过差异基因表达分析共得到250条差异基因,其中159条差异基因共表达,128条上调,31条下调。将差异基因进行富集分析发现,苦参碱可以干扰真菌多个代谢通路,但在糖酵解过程和氧化磷酸化通路中差异基因富集最显著,与前面试验结果相同。5.为了减少化学杀菌剂在田间的使用,提高对山核桃干腐病病原菌的防治效果,本试验采用生长速率法测定苦参碱对8种农药单剂的增效作用。结果显示:通过共毒因子法发现苦参碱与甲基托布津复配效果最好,而与百菌清和代森锰锌呈拮抗作用,与戊唑醇、苯醚甲环唑、铜喹啉和恶醚唑呈相加作用。利用共毒系数法定量分析苦参碱对甲基托布津增效作用发现,当复配比例为5:5时增效作用最显著(CTC=197.605)。结果表明,苦参碱对甲基托布津的增效作用明显,实际应用时可以有效降低苦参碱的使用成本,减少甲基托布津用量,降低对环境污染和病原菌抗药性的产生。