【摘 要】
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目的本研究旨在优化慢病毒感染类器官的方法,并以此方法构建过表达胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）的小肠类器官,从而为临床上治疗Ⅱ型糖尿病提供一种新的策略。方法设计扩增GLP-1/Fc目的片段的引物,用AgeI和XbaI两种限制性内切酶酶切获取GLP-1/Fc序列,并克隆到慢病毒载体pLenti-CMV-IRES2-ZsGreen上,构建重组慢病毒质粒p
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目的本研究旨在优化慢病毒感染类器官的方法,并以此方法构建过表达胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）的小肠类器官,从而为临床上治疗Ⅱ型糖尿病提供一种新的策略。方法设计扩增GLP-1/Fc目的片段的引物,用AgeI和XbaI两种限制性内切酶酶切获取GLP-1/Fc序列,并克隆到慢病毒载体pLenti-CMV-IRES2-ZsGreen上,构建重组慢病毒质粒pLenti-CMV-GLP-1/Fc-IRES2-ZsGreen。将构建好的重组质粒进一步转化到DH5α感受态细菌中,过夜培养后挑选阳性单克隆,扩增后提取DNA进行质粒测序,根据测序结果选取正确的重组质粒。用重组质粒转染293T细胞48h后于荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。进一步将重组的慢病毒质粒与慢病毒辅助包装质粒pMD2.G及psPAX2共转染293T细胞,进行慢病毒的包装与浓缩并测定慢病毒滴度。利用上述慢病毒感染小肠类器官,并优化感染条件,以实验最佳的感染效果。采用ELISA方法对GLP-1/Fc的活性进行检测,并对野生型及糖尿病小鼠分别实施葡萄糖耐受实验。取GFP小鼠隐窝在体外培养成自带绿色荧光的肠类器官并进一步原位移植到小鼠肠壁中,观察肠类器官的整合情况。结果经过测序验证,成功构建了 pLenti-CMV-GLP-1/Fc-IRES2-ZsGreen重组质粒。当感染复数MOI为1000时,慢病毒感染肠类器官的效果最佳。进一步将培养的肠类器官进行传代,发现GLP-1/Fc能够持续稳定的表达。ELISA结果表明,GLP-1/Fc过表达的肠类器官上清中GLP-1 的活性较野生型小鼠肠类器官明显增强。注射过表达GLP-1/Fc肠类器官的上清可以显著提高野生型和糖尿病小鼠的糖耐受能力。最后,通过原位移植实验证实GFP小鼠体外培养的肠类器官能够成功整合到受体小鼠体内。结论综上所述,本研究成功构建了 GLP-1/Fc过表达的慢病毒载体,获得了能够稳定表达GLP-1/Fc的肠类器官,为今后Ⅱ型糖尿病的治疗奠定了一定的实验基础。图10表3参51
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