谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)作为一种外源蛋白表达宿主具有无致病性、不产生内毒素、在食品安全指标上具有明显的优势,且可以分泌正确折叠的活性蛋白直接到胞外上清液中,提高下游纯化效率、无蛋白酶降解目的蛋白等优点。在发酵过程中,溶氧(Dissolved Oxygen,DO)是一个对细胞的生长、维持、代谢、产量至关重要的影响因素,研究不同溶氧条件下谷氨酸棒杆菌的物质和能量的变化对于工艺控制有重要的意义。而目前,溶氧影响谷氨酸棒杆菌代谢的具体调控机制还没有详细阐述。近年来在谷氨酸棒杆菌中对代谢途径的改造主要用于内源代谢产物的提高,但是研究代谢途径为构建高效表达外源蛋白体系的研究却鲜有报道。本课题为解析DO对表达外源蛋白的谷氨酸棒杆菌代谢的影响机制,系统和深入的探究并找到影响其代谢的关键基因,对加以改造而构建高效表达外源蛋白的体系为目的,以C.glutamicum野生菌株(C.glutamicum BZH 001)和表达外源蛋白EGFP的工程菌株(C.glutamicum EGFP)为研究对象,通过检测0、30%、50%3种溶氧水平下代谢的相关研究。包括胞内外有机酸、氨基酸的含量,代谢途径中关键酶的活性及其关键基因的表达以及胞内还原电势和ATP含量,研究了发酵过程中不同溶氧水平下相关物质和能量代谢的变化情况。主要实验结果主要如下:1、不同溶氧对C.glutamicum BZH 001和C.glutamicum EGFP的生长有很大的影响,在高DO为30%和50%的情况下,菌浓差异不大,但进一步限制DO为0时,菌体生长受到限制,前期低DO抑制菌体的生长,而中后期高DO不利于菌体的存活。2、不同DO对C.glutamicum BZH 001和C.glutamicum EGFP的代谢有很大的影响,在高DO下有高的碳通量,能快速的形成产物等。而在氧气为0的时候,细胞内氧化磷酸化减弱,导致维持生命活动所必需的ATP供应减少,因此细胞通过增强底物水平磷酸化来产生ATP以满足生命活动的需求。在此情况下,胞内NADH得到较多积累,TCA循环代谢流量减小,而转向糖酵解、乙醛酸循环等,并且这个过程伴随多种杂酸包括乳酸、缬氨酸、乙酸等的产生必将影响目的产物的产量。3、不同DO下C.glutamicum EGFP的外源蛋白的表达量也不一样。综合分析DO为30%的情况下的更适合EGFP蛋白的表达,DO为0的时候,EGFP蛋白含量明显偏低,荧光值最高也仅为DO 50%最高值的66.56%,但蛋白表达的变化趋势相似,后期没有明显下降,可见蛋白活性较稳定。4、EGFP的表达对C.glutamicum的代谢又有一定的影响,在DO 30%的情况下,C.glutamicum EGFP生长衰亡均延迟,糖异生途径降低而消耗更多的补料,碳源进入TCA循环通量加大,糖酵解途径升高,伴随着更多的代谢物包括谷氨酸、甘氨酸、乳酸、乙酸的产生,加重了碳源的外溢。5、外源蛋白的表达引起了C.glutamicum中许多代谢途径关键基因表达的变化,如TCA途径的aceE等的上调,使得TCA循环加强;编码ATP合酶的atpC等的上调,使得ATP的合成更多;编码核糖体蛋白基因的rpmF、rpsT等的上调,使得蛋白质的合成6、等处于更高的水平,同时也有利于外源蛋白的合成;Sec途径的SecG、SecE等,编码转运蛋白ATP酶的NCgl0909、NCgl1937的上调,使得跨膜运输相对阻碍更小,胞内产生的一些代谢物质更容易分泌到胞外。以上结果进一步阐明了不同DO水平对谷氨酸棒杆菌的生长代谢的影响,因而在优化策略上,可以在生长期控制较高DO,使其快速充分生长,而在中后期降低DO水平,使其大量生产并积累产物,减少生长所消耗碳源的比例。研究发现不同DO对谷氨酸棒杆菌外源蛋白表达的代谢影响的机制,并发现大量与代谢流变化相关的差异表达基因,为找到改造基因组的作用位点改变宿主细胞代谢流而奠定基础,因而研究谷氨酸棒杆菌外源蛋白表达过程中的代谢机制具有较高的学术价值和广泛的应用前景。