大豆在我国粮食产业中占据着非常重要的地位,与我们的生活息息相关。然而,田间杂草生长过盛是导致大豆作物减产的主要原因之一。为有效控制田间杂草,草甘膦凭借其高效的除草优势占据着除草剂市场的主导地位。但草甘膦在发挥其高效除草优势的同时也不加选择地对农作物造成了伤害。因此,培育抗草甘膦作物成为科学家们研究的热点之一。草甘膦抗性基因是培育抗草甘膦作物的基础。在当下转基因作物食品安全性备受争议的局势,挖掘源于植物安全性较高的草甘膦抗性基因就显得尤为重要。本研究通过对吉育72大豆中编码EPSPS酶的GmaroA基因(GmaroA1和GmaroA2)的表达情况进行了分析;并将GmaroA1和GmaroA2基因克隆到了植物表达载体中,通过大豆发状根瞬时转化体系初步鉴定了GmaroA1和GmaroA2基因的功能;并通过在拟南芥中过表达及突变体回补GmaroA1基因进一步鉴定了其草甘膦抗性相关功能;最终进行了GmaroA1基因编码酶活中心的T(183)I和P(187)S双氨基酸突变的GmaroA1(TIPS)基因的克隆及原核表达分析。具体研究结果如下:1、采用实时荧光定量PCR技术对GmaroA1/GmaroA2基因在大豆不同组织及草甘膦胁迫下的表达进行分析,结果表明:在大豆的根和叶片组织中GmaroA1/GmaroA2基因的相对表达量较高;经不同时间草甘膦胁迫处理后发现,大豆幼苗根和叶组织中GmaroA1和GmaroA2基因的表达先适应性增高,但2-3天以后,大豆幼苗生长稳态遭到破坏,基因表达显著降低。2、应用RT-PCR技术从吉育72大豆中克隆了GmaroA1和GmaroA2基因。序列同源比对分析发现,GmaroA1基因与GenBank中(Williams82大豆)的序列比对一致;而GmaroA2基因经多次克隆发现与发布序列存在10个碱基的差异。3、在发根农杆菌K599的介导下,GmaroA1和GmaroA2基因被转化到了诱导的大豆发状根中,结果显示:在不同浓度的草甘膦胁迫下,超表达GmaroA1/GmaroA2基因的大豆发状根株系较对照组长势良好,叶片中莽草酸积累量明显少于对照组,且叶绿素含量高于对照组。初步证明了GmaroA1和GmaroA2基因可能参与莽草酸途径并与草甘膦耐受性相关。4、采用根癌农杆菌EH105介导的拟南芥花絮侵染法,基因GmaroA1被转入野生型拟南芥及突变体拟南芥中。对筛选到的T3代转基因拟南芥进行草甘膦抗性表型分析。发现超表达及回补型转基因拟南芥长势良好,而对照组拟南芥生长情况受到草甘膦抑制。进一步证明了GmaroA1基因具有提高拟南芥草甘膦耐受性的功能。5、采用OverlapPCR方法成功克隆了GmaroA1基因编码酶活中心的T(183)I及P(187)S氨基酸突变的GmaroA1(PS)基因和GmaroA1(TIPS)基因,并将这些基因构建至pET-22b原核表达载体中,通过Western Blot检测证明了经IPTG诱导后GmaroA1及其编辑形式基因在大肠杆菌中的蛋白得到了很好的表达,可为进一步的GmaroA1及其编辑形式基因在大肠杆菌原核系统中的抗性功能及酶活性分析奠定基础。