目前,主要的半合成β-内酰胺类抗生素-阿莫西林的生产通常以青霉素G为底物,在水解用青霉素G酰化酶(PGA)催化下,裂解获得母核6-APA,再在合成用青霉素G酰化酶(SPGA)的作用下,新侧链与母核缩合,合成新型β-内酰胺类抗生素。通过资料分析发现若以青霉素V为底物,利用青霉素V酰化酶(PVA)催化生产β-内酰胺半合成抗生素具有独特优势,如高反应底物浓度、高转化率。因此,以青霉素V为起始原料生产半合成β-内酰胺抗生素改变以往传统工艺,将会产生较好的社会效益和经济效益。本文通过对青霉素V酰化酶、合成用青霉素G酸化酶进行定向进化改造和全水相中合成阿莫西林的工艺研究,获得了催化效率更高、酶学性质更好的两种突变酶PVA、PGA及两酶联用在全水相中合成阿莫西林的工艺。以下为本文的主要研究成果:1、以来源于球形芽抱杆菌(Bacillus sphaericus)的PVA(BsPVA-wt)为出发点(基因登录号:M15660.1),采用定向进化技术手段对BsPVA-wt进行突变研究,获得了高催化效率的突变体BspPVA-3。经多轮随机突变和定点饱和突变筛选,最终获得了特异性活性和催化效率比野生型分别提高12.4倍和11.3倍的三突变体BspPVA-3(T63S/N198Y/S110C)。对 BsPVA-wt BspPVA-3 的酶学性质进行研究,发现二者最适pH均为6.0,BsPVA-wt最适温度为50℃,而BspPVA-3最适温度为60℃。对蛋白活性进行分析发现,BsPVA-3的比活比野生型提高了 9倍,固定化酶活力由92U/g提高到820U/g,在浓度为30%的青霉素V钾盐条件下孵育1小时,活性残余89.1%;将突变体BsPVA-3固定化酶,在pH6.0,25℃条件下,裂解25%浓度的青霉素V制备6-APA,其反应时间由180分钟缩短到60分钟,底物转化率提高至99.5%以上,且连续使用批次达600批以上,活力无明显损失,具有良好的操作稳定性。有文献报道,蛋白氢键网络的改变可能对酶的活性大小产生影响。因此,我们利用同源建模进行比对分析,结果发现BspPVA-3的T63S突变可能对BspPVA-3酶活的提升起到了关键性作用,当Thr63突变成Ser63后,与周边的两个氨基酸残基Asp64及Lys-31形成了额外的两个氢键。突变后的BspVA-3性质优良,极大程度地降低了生产成本,提高了生产效率,适合于工业化应用。2、为了提高SPGA的合成活力,本文以木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylsoxidans)来源的PGA为出发点(基因登录号:AF490005),利用计算机辅助设计技术、基因定点饱和突变技术,结合高通量的筛选方法对该酶进行了定向进化研究,获得了突变型SPGA-4,并对SPGA-4突变体酶进行了蛋白表达、分离纯化与固定化研究,结果表明:SPGA-4突变体酶的合成活力提高了 5.6倍,水解活力下降了 8.7倍,合成水解比(S/H)值提高了 8倍,突变酶SPGA-4在pH 2.0的条件下,处理60 min,酶活残留79%。将固定化的突变体酶SPGA-4用于催化合成阿莫西林,对底物的转化率达到99%以上,固定化酶可以重复使用300批次以上。以上结果表明,该突变体酶具有合成活力更高、稳定性更好、耐酸性更强、水解活力更低等优点,可以应用于生产。3、开发了新型的全水相生物催化合成方法。利用突变型青霉素V酰化酶和突变型合成用青霉素G酰化酶进行阿莫西林的合成研究,获得了全水相合成阿莫西林的最佳工艺条件为:反应体系中青霉素V钾浓度为20%,反应pH为6.2,反应温度为15℃,反应体系中6-氨基青霉烷酸(6-APA)与D-对羟基苯甘氨酸甲酯(D-HPM)的摩尔比为1:1.03,最佳催化反应时间为75-85min。在该工艺条件下,阿莫西林的摩尔收率高达91%以上,液相纯度达99.8%。利用该方法可以在全水相中一步法合成阿莫西林,并且生产过程中,无需用到有机溶剂,副产物苯氧乙酸可以回收利用,因此,该方法合成的阿莫西林的比以往化学法合成的质量更好,纯度更高。