研究背景：　　 近年研究证明，COX-2可通过上调前列腺素E2及其受体并激活蛋白激酶信号通路，上调肿瘤微环境中VEGF，从而对非小细胞肺癌的发展、肿瘤转移及分子靶向治疗耐药的产生重要作用[1]。然而对于不同的非小细胞肺癌细胞株，COX-2具体通过PGE2下游的哪一条信号通路上调VEGF仍未成定论。　　 本研究通过将COX-2、PKA选择性抑制剂、PKC选择性抑制剂及EP1/EP2选择性抑制剂作用于各非小细胞肺癌细胞株，观察肿瘤细胞形态及VEGF表达量的变化，从而研究蛋白激酶信号通路在不同非小细胞肺癌细胞株中对COX-2上调VEGF作用的影响。　　 研究目的：　　 研究非小细胞肺癌细胞株，不同蛋白激酶(protein kinase，PK)信号通路对环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)上调血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)作用的影响。检测COX-2作用于各同非小细胞肺癌细胞株的EC50值。　　 研究方法：　　 1细胞培养　　 A549细胞株用80％1640+20％胎牛血清培养，H460、A431及HBE用90％DMEM+10％胎牛血清培养，皆于5％CO2，37℃孵育。细胞贴壁长满培养瓶后传代，将细胞传至4代后进行实验。　　 2检测COX-2促进非小细胞肺癌细胞增殖的EC50值　　 将培养瓶中的贴壁细胞用无血清培养基冲洗3遍，以0.25％胰酶消化3-5分钟，使细胞间连接断开呈单细胞悬液，以含血清培养基中和胰酶。将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100ul细胞悬液，使每孔细胞约8×103个(边缘孔用无菌PBS填充)。5％CO2，37℃孵育12小时后，将COX-2原液稀释为0-3000倍浓度梯度，分别加入96孔板中。5％CO2、37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20ul5mg/ml MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。同时设置空白对照组(培养基)，阴性对照组(细胞)。细胞生存力=药物组平均吸光光度值/阴性对照组平均吸光光度值，由细胞生存力与药物浓度在EXCEL中行线性回归分析，得出EC50值。上述过程，每株细胞重复3次。　　 3流式细胞技术定量检测VEGF的表达　　 3.1证实在各非小细胞肺癌细胞株中，COX-2可促进VEGF上调　　 将培养瓶中的贴壁细胞用无血清培养基小心冲洗3遍，以0.25％胰酶消化3-5分钟，使细胞间连接断开呈单细胞悬液，以含血清培养基中和胰酶。将细胞接种于6孔板中，每孔加入1.5ml使每孔细胞约5×105个。5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(约12-24小时)。血清饥饿12小时，从0-2倍EC50建立COX-2浓度梯度作用于各细胞株.设3个复孔，5％CO2，37℃孵育12小时，以0.25％胰酶消化3-5分钟，使细胞间连接断开呈单细胞悬液，分孔收集细胞，分别用鼠抗人VEGF一抗及兔抗鼠二抗标记各组细胞表达的VEGF，并以流式细胞技术检测各浓度梯度组VEGF的吸光率，分析吸光率的几何平均数与COX-2浓度间的关系。　　 3.2检测COX-2、AH6809、KT5720、RO-31-8425作用于各非小细胞肺癌细胞株后VEGF表达量的变化　　 将培养瓶中的贴壁细胞用无血清培养基小心冲洗3遍，以0.25％胰酶消化3-5分钟，使细胞间连接断开呈单细胞悬液，以含血清培养基中和胰酶。将细胞接种于6孔板中，每孔加入1.5ml使每孔细胞约5×105个。5％CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(约12-24小时)。血清饥饿12小时，设置不加药物细胞组、COX-2组、COX-2+AH6809组、COX-2+KT5720组、COX-2+RO-31-8425组、AH6809组、KT5720组、RO-31-8425组，在COX-2组、COX-2+AH6809组、COX-2+KT5720组、COX-2+RO-31-8425组中先加入已测得浓度得COX-2，每组设置6个复孔，继续5％CO2，37℃孵育12小时，分别在COX-2+AH6809组、COX-2+KT5720组、COX-2+RO-31-8425组、AH6809组、KT5720组、RO-31-8425组中加入所需抑制剂剂，继续5％CO2，37℃孵育12小时，终止培养，以0.25％胰酶消化3-5分钟，使细胞间连接断开呈单细胞悬液，分别用鼠抗人VEGF一抗及兔抗鼠二抗标记各组细胞表达的VEGF，并以流式细胞技术检测各浓度梯度组VEGF的吸光率，上述过程，每株细胞重复3次。对各组细胞表达VEGF吸光率的几何平均数进行T检验。　　 4统计学处理　　 数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，用SPSS11.0统计软件分析。　　 研究结果：　　 1 COX-2作用于A549、H460及A431的EC50值(MTT法)COX-2作用于A549、H460及A431的EC50值分别是：8.95nmol/l，11.2nmol/l及8.44nmol/l。COX-2对HBE细胞的增长无明显影响。　　 2 COX-2在一定浓度范围内，可促进非小细胞肺癌细胞株的增殖。　　 3 PKC选择性抑制剂可明显抑制由COX-2引起的VEGF的上调；在大细胞肺癌细胞株中，EP2选择性抑制剂对由COX-2引起的VEGF的上调有一定的影响。　　 在各非小细胞肺癌细胞株中，蛋白激酶C(PKC)选择性抑制剂可明显抑制由COX-2引起的VEGF的上调，而蛋白激酶A(PKA)选择性抑制剂的此种抑制作用不明显。在大细胞肺癌细胞中，EP2选择性抑制剂对由COX-2引起的VEGF的上调有一定的影响。　　 结论：　　 在非小细胞肺癌细胞株中，由COX-2过表达引起的VEGF的上调与PKC激酶信号系统有关；对大细胞肺癌细胞株H460，由COX-2过表达引起的VEGF的上调还可能与PGE2受体2(EP2)有关。