仔猪腹泻引起的仔猪死亡约占仔猪断奶前死亡的39%。引起仔猪腹泻的原因主要有:饲料源的霉菌毒素污染,如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）;微生物源的大肠杆菌及其产物,如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）;腹泻病毒源的感染,如仔猪流行性腹泻病毒（piglet epidemic diarrhea virus,PEDV）等。研究表明,足量的初乳摄入,能够显著降低仔猪断奶前的腹泻率和死亡率,这种保护作用一方面由于初乳包含丰富的营养以及大量抗体,另一方面是由于初乳富含一种由细胞分泌的细胞间信号传导微囊泡-外泌体（Exosomes）。外泌体是一类由细胞通过内吞作用形成的直径为40～100 nm的膜上小囊泡,可包裹m RNA、miRNA、蛋白质等多种物质可在细胞间进行信号交流。曾有报道,人乳外泌体被婴儿肠上皮细胞摄取后,调控其体内的基因表达,最终影响身体多个系统的成熟和发育。本论文在课题组前期对猪乳外泌体进行miRNA Solexa测序的基础上,分别构建不同环境因素（DON、LPS和PEDV）诱导的肠道损伤和腹泻模型,阐明猪乳外泌体在促进肠道发育、抵抗环境因素诱导的肠道损伤方面的功能及其分子机制。因此,本论文开展了以下四方面的研究:试验一,以仔猪空肠上皮细胞系IPEC-J2细胞和18日龄昆明小鼠为研究对象;在前期试验室证明猪乳外泌体促进IPEC-J2细胞增殖的基础上,首先,通过生物信息学分析、定量PCR、Western Blot和双荧光素酶报告基因等试验方法,检测细胞增殖相关基因的表达并解析猪乳外泌体miRNAs通过调控细胞中的基因表达影响细胞的增殖。随后,通过猪乳外泌体灌服小鼠、肠道组织切片观察、定量PCR和Western Blot方法,明确猪乳外泌体对小肠绒毛发育的影响。结果表明,猪乳外泌体能够显著促进IPEC-J2细胞增殖相关基因Cdx2、PCNA和IGF-1R表达,抑制细胞增殖负相关基因Tp53表达。此外,猪乳外泌体通过其内含的miR-769-3p和miR-181a分别靶向细胞中SERPINE1和Fas基因,抑制p53信号通路,从而促进细胞增殖。小鼠活体试验同样表明猪乳外泌体促进小鼠小肠绒毛发育,并促进细胞增殖相关基因Cdx2、PCNA和IGF-1R表达,抑制Tp53基因表达。试验二,同样以IPEC-J2细胞和18日龄昆明小鼠为研究对象;首先,通过向细胞添加基础培养基（对照）和猪乳外泌体处理IPEC-J2细胞24小时,再对细胞进行DON处理,通过MTT和Edu方法验证外泌体能否缓解DON造成的肠上皮细胞的损伤作用以及细胞增殖抑制作用;其次,通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因、定量PCR和Western Blot检测细胞间紧密连接相关蛋白、细胞凋亡和细胞增殖相关基因表达,明确猪乳外泌体缓解DON毒性的分子机制;最后,将小鼠分成四组,分别是生理盐水组（对照）、猪乳外泌体组（Exos）、DON攻毒组（Saline+DON）和处理组（Exos+DON）,构建DON诱导的小肠黏膜损伤模型,通过形态学观察和Western Blot方法明确外泌体能否缓解DON造成的肠道损伤。结果表明,猪乳外泌体处理细胞后,缓解了DON对肠上皮细胞的毒性以及对细胞的增殖抑制作用,并逆转DON对上皮细胞间紧密连接的破坏作用。进一步分析发现,猪乳外泌体通过其内含的miR-30c和miR-365-5p分别抑制SERPINE1和Tp53基因的表达来抑制DON诱导的细胞凋亡;同样,猪乳外泌体能够显著降低DON对昆明小鼠空肠绒毛的毒性影响,并且可逆转DON对细胞增殖相关基因β-catenin、CCND1和Akt的抑制作用,升高Akt的磷酸化水平,以及逆转DON对细胞凋亡相关蛋白p53和p21的促进作用。试验三,同样以IPEC-J2细胞和18日龄昆明小鼠为研究对象;将小鼠分成三组,分别是生理盐水组（对照）、LPS攻毒组（LPS）和处理组（Exos+LPS）,构建LPS诱导的小肠黏膜损伤模型,通过小肠组织形态观察和ELISA检测,明确猪乳外泌体对LPS诱导的小鼠小肠绒毛损伤和血清及肠黏膜中促炎症因子的影响;其次,使用基础培养基、猪乳外泌体和LPS处理IPEC-J2细胞,通过免疫荧光、定量PCR、Western Blot和ELISA检测,明确猪乳外泌体对LPS诱导的细胞炎症因子分泌和细胞凋亡的影响;最后,通过生物信息学分析、免疫荧光、双荧光素酶报告基因、定量PCR、Western Blot和流式细胞技术阐明猪乳外泌体miRNAs阻断LPS诱导细胞炎症及细胞凋亡的分子机制。结果表明:猪乳外泌体可缓解LPS引起的肠绒毛损伤,抑制LPS诱导的促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌。猪乳外泌体处理后,可升高IPEC-J2细胞中miR-4334和miR-219水平,并且miR-4334和miR-219分别靶向TLR4和My D88基因,最终抑制NF-κB信号的激活,从而阻断LPS引起的促炎症因子分泌;而miR-338则通过靶向Tp53基因,抑制Tp53基因表达,阻断促炎症因子诱导的细胞凋亡。此外,研究表明三种miRNAs的协同效应在抵抗LPS引起的细胞凋亡和炎症因子分泌方面的作用要强于单一的miRNA作用,从而能够更好的阻断LPS引起炎症因子分泌和细胞凋亡。试验四,以肠上皮细胞系IPEC-J2细胞、PEDV易感细胞Vero E6（对照）和初生长白小公猪为研究对象;首先,在IPEC-J2和Vero E6细胞上通过结晶紫染色和MTT染色方法,明确猪乳外泌体是否影响PEDV对小肠上皮细胞的感染;其次,通过绝对定量PCR和Western Blot,明确猪乳外泌体是否影响PEDV在小肠上皮细胞中的复制;最后,对初生仔猪进行PEDV攻毒,通过空肠组织形态观察、空肠组织免疫荧光、绝对定量PCR、Western Blot和ELISA检测,明确猪乳外泌体能否阻止PEDV在肠上皮细胞中的复制和减少仔猪腹泻。结果表明,猪乳外泌体可以降低PEDV对IPEC-J2和Vero E6细胞的感染并且减少PEDV在细胞中的复制。此外,猪乳外泌体可以促进仔猪肠绒毛发育,抑制PEDV在肠黏膜的复制和降低PEDV对肠绒毛的损伤作用,从而减缓PEDV引起的仔猪腹泻。最后,本论文在猪乳外泌体中检测到PEDV特异性抗体的存在,表明猪乳外泌体发挥抑制PEDV复制和降低感染上皮细胞的作用可能通过其包含的PEDV特异性抗体实现。综上所述,猪乳外泌体可通过其包含的miRNAs调控肠上皮细胞增殖、凋亡和炎症相关信号通路基因的表达,促进上皮细胞增殖、抑制炎症和凋亡的发生,最终促进小肠绒毛发育,增强肠道抵御有害因子DON、LPS和PEDV对肠绒毛的损伤作用和腹泻。该研究结果不仅弥补了猪乳外泌体调控仔猪肠道发育的空白,更进一步挖掘了猪乳外泌体及其包含miRNAs在调控仔猪小肠上皮细胞发育和减缓肠道损伤过程中的作用及其分子机制,为提出乳功能性物质调控肠道发育的新机制。