精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是雄性哺乳动物精子发生及具有生育能力的基础。精原干细胞移植技术在扩大优秀公畜配子供应、制备转基因动物、治疗不孕症、瀕危物种保护等方面有广阔的应用前景。然而,在畜牧类大动物上精原干细胞移植技术的发展较为缓慢。精原干细胞移植技术成功的关键因素是SSCs增殖的培养以提供足够数量的SSCs和制备SSCs缺失而支持细胞功能完整的雄性受体。本研究通过差速贴壁获得猪SSCs并进行体外增殖培养,初步建立猪SSCs体外培养体系;尝试基因编辑技术及白消安直接注射睾丸的方法制备生殖细胞清除的受体,进行外源SSCs的移植生产供体的精子。本研究旨在通过猪精原干细胞移植技术的建立生产出代精公猪,采用SSCs移植到代精公猪生产大量精子,替代目前公猪克隆技术。主要研究结果如下:1、选用3-7日龄大白仔猪睾丸作为材料来源,通过差速贴壁法得到UCHL-1阳性生殖细胞比例最高为18.59±0.94,收集上层细胞进行流氏分析得到UCHL-1阳性细胞比例达50%以上;不同生长因子组合添加试验发现GDNF 20 ng/ml、IGF10 ng/ml及b FGF 20 ng/ml的添加对大白仔猪SSCs的增殖效果最佳;以支持细胞作为饲养层,添加1%血清、GDNF、LIF、b FGF的体系对SSCs进行体外培养,培养15d后出现大批SSCs集落,实现了SSCs的大量增殖。2、利用CRSPR/Cas9系统及体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）得到7头ETV5基因纯合敲除猪,阳性率为100%;敲除猪主要器官组织正常证明ETV5基因敲除后不会对猪造成致命风险;ETV5基因敲除猪出生后睾丸发育正常,8月龄时血液中睾酮水平正常,生精小管中SSCs没有出现明显凋亡的现象,生精小管结构正常并能产生大量精子。3、不同剂量3、5 mg/kg的白消安直接注射杜洛克公猪睾丸对其健康及生长没有明显影响;3、5 mg/kg的剂量能够有效清除杜洛克猪内源SSCs并且作用时间长,生精小管中生殖细胞数量显著减少,生精小管直径显著小于对照组;白消安注射前期对猪造血功能有一定影响,随着猪的生长发育,3 mg/kg的注射对猪造血功能的影响逐渐消失;免疫组化及基因表达检测证实了内源SSCs基本清除而支持细胞保持稳定;将3-7日龄大白仔猪SSCs移植入杜洛克受体的睾丸中,移植80天后检测到供体SSCs的定植并能生成精子。SSCs的体外培养及受体的制备至关重要,本研究初步建立了猪SSCs体外培养体系,尝试了基因编辑技术和白消安直接注射睾丸制备受体的两种方法,ETV5的敲除在8月龄时未能出现SSCs凋亡的现象,而白消安直接注射睾丸的方法得到了生殖细胞清除的受体,没有造成猪明显的健康问题,为外源精原干细胞的移植提供了适宜的内环境,表明白消安直接注射睾丸是一种高效、安全的方法。通过移植实现了供体SSCs的定植及精子生成,为猪精原干细胞移植技术的建立打下了良好的基础。