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背景与目的多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system,CNS）炎性脱髓鞘为主要病变特征的慢性自身免疫性疾病,临床主要表现为运动神经元功能紊乱,是中青年人神经性伤残的主要原因之一。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）是MS最重要的动物模型,具有与MS相似的病理学特征-病灶部位炎性细胞浸润及脱髓鞘现象,已被学者广泛应用于MS的发病机制及治疗的研究。MS的病因和发病机制尚未完全阐明,通常认为免疫异常是MS发病的重要因素。目前治疗MS的药物主要是基于免疫抑制和调节的抗炎类药物,这些药物能够减轻疾病的活动,但只适用于某些特定类型患者。中药制剂在我国使用历史悠久,很多具有免疫调节功能,同时可拮抗激素和免疫抑制剂带来的副作用,达到抗炎、调节免疫平衡的目的。冬凌草甲素（oridonin,ORI）,一种四环素二萜类化合物,具有抗炎、诱导细胞凋亡的作用,常用于抗炎治疗。研究发现,ORI可抑制T细胞免疫应答,对实验性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）模型小鼠有治疗作用。ORI对EAE的治疗作用尚未见报道。EAE实质是T细胞介导的针对自身髓鞘抗原产生的炎症反应,因此我们推测ORI可通过作用于T细胞,预防和治疗EAE。本实验以MS的动物模型EAE小鼠为研究对象,探讨ORI对EAE的预防和治疗作用及其可能的分子作用机制,为ORI用于临床治疗MS提供理论依据。方法1 EAE小鼠模型的诱导用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55)皮下免疫C57BL/6小鼠诱导EAE动物模型。2实验小鼠分组及给药随机将小鼠分为3组:（1）EAE对照组（Vehicle,n=24）;（2）ORI预防组（n=24）;（3）ORI治疗组（n=12）。EAE小鼠诱导的第1、3、5天,ORI预防组给予腹腔注射ORI（15mg/kg/d）,EAE对照组给予等量的PBS。EAE小鼠发病进展期（免疫后第1230天）,ORI治疗组给予腹腔注射ORI（15mg/kg/d）,EAE对照组给予等量的PBS,每天一次。3 EAE评估每日观察EAE小鼠发病情况并记录发病时间、临床评分。4组织化学染色取对照组和预防组小鼠脊髓,切片,苏木素-伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色观察脊髓组织病理改变。5细胞检测取对照组和预防组小鼠脾脏和CNS,制成单个核细胞悬液,光学显微镜下细胞计数,流式细胞仪检测脾脏和CNS浸润CD4+T、CD8+T、CD19+B和CD11b+细胞所占的比例。6 MOG肽特异性T细胞增殖实验一,T细胞增殖实验（ex vivo）:取对照组和预防组小鼠脾脏细胞,CFSE标记,加入不同浓度的MOG肽（0,10,20μg/mL）,培养72h,流式细胞仪检测CD4+T细胞中增殖细胞所占的百分比。二,T细胞增殖实验（in vitro）:取对照组小鼠脾脏细胞,CFSE标记,MOG肽（20μg/mL）刺激淋巴细胞增殖,同时加入不同浓度的ORI（0,1.25,2.5,5μM）,培养72h,流式细胞仪检测CD4+T细胞中增殖细胞所占的百分比。7 T细胞亚群检测取对照组和预防组小鼠脾脏和CNS,制备单个核细胞悬液,加入MOG肽（20μg/mL）,培养5h,流式细胞仪检测脾脏和CNS浸润Th1、Th17细胞所占的比例。取对照组和预防组小鼠脾脏和CNS,制成单个核细胞悬液,流式细胞仪检测脾脏和CNS浸润CD4+Foxp3+Treg细胞所占的比例。8细胞因子检测取对照组和预防组小鼠脾脏细胞,加入MOG肽（20μg/mL）,培养48h,ELISA检测脾脏细胞培养上清液中IFN-γ、IL-17和IL-4、IL-10细胞因子水平。9 Westernblot一:取对照组和预防组小鼠脾脏细胞,加入MOG肽（20μg/mL）,培养24h,westernblot检测NF-κB及ERK/c-fos、JNK/c-jun蛋白表达水平。二:取对照组小鼠脾脏细胞（splenocytes）,分三组:第一组splenocytes空白对照（Control）,第二组splenocytes+MOG肽（20μg/mL）,第三组splenocytes+MOG肽（20μg/mL）+ORI（5μM）,培养4h,westernblot检测NF-κB及ERK/c-fos、JNK/c-jun蛋白表达水平。10统计学处理用GraphPad Prism5.0统计软件进行统计分析,临床症状评分、淋巴细胞所占百分比用X—±S表示,通过单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。结果1、ORI可有效减轻EAE症状:MOG肽免疫小鼠成功建立EAE动物模型;EAE小鼠从诱导的第89天开始发病,以尾巴无力为首发症状,继而出现尾巴瘫痪,后肢无力、瘫痪,严重者可累及前肢或头部;发病前给予小鼠ORI腹腔注射,可显著延长小鼠发病时间,降低EAE的严重程度;EAE疾病进展期给予ORI治疗可使EAE临床症状缓解。2、脊髓组织病理学改变:H&E染色结果显示,对照组小鼠脊髓组织有大量的炎性细胞浸润,预防组小鼠脊髓组织炎性细胞浸润显著减少。3、细胞数变化:利用光学显微镜计数CNS浸润单个核细胞总数,结果表明预防组小鼠CNS浸润细胞总数显著减少。4、细胞亚群变化:流式细胞学分析表明,预防组小鼠脾脏和CNS浸润CD4+T细胞比例显著减少,CD11b+、CD8+T和CD19+B细胞比例无明显变化。5、MOG肽特异性T细胞增殖实验:流式分析表明,ORI体内治疗或ORI体外处理显著抑制MOG肽诱导的CD4+T细胞的增殖。6、T细胞亚群变化:流式结果表明,预防组小鼠脾脏和CNS浸润Th1和Th17细胞比例显著降低,CD4+Foxp3+Treg细胞比例无明显变化。7、细胞因子的检测:ELISA检测MOG反应性T淋巴细胞细胞因子分泌情况,结果显示ORI的治疗显著降低脾脏细胞培养上清液中炎性细胞因子IFN-γ和IL-17的分泌,对抗炎细胞因子IL-4、IL-10表达无明显作用。8、炎症信号通路相关蛋白表达水平:westernblot结果表明,ORI体内治疗或ORI体外处理均可上调脾脏细胞IκBα表达,抑制p-IκBα、p-ERK、p-JNK、p-c-jun、c-fos表达。结论1、ORI可用于EAE的预防和治疗。2、ORI的预防和治疗作用可能与其抑制髓鞘抗原反应性T细胞增殖、Th1和Th17细胞分化有关。3、ORI通过作用于NF-κB及ERK/c-fos、JNK/c-jun信号通路转导,抑制MOG反应性Th1、Th17细胞分化,预防和治疗EAE。