研究背景和目的:目前研究表明,银屑病是一种多基因遗传背景上,受遗传、外伤、感染、代谢障碍、药物、精神心理因素等诱发的一种慢性免疫性疾病,其发病率高,难以治愈,易复发。Th1/Th2失衡是银屑病的重要发病机制,过去已经做了很多研究,但随着对Th17细胞的研究深入,有更多证据发现Th17/Treg失衡在银屑病的发病中也起着非常重要的作用。IL-23刺激Th17细胞的分化和增殖,使得Th17细胞分泌高水平的IL-17介导炎性反应、自身免疫病,IL-23/Th17通路是近年研究发现的一种炎症性通路,与银屑病的发病密切相关。Treg细胞则作为负向调节细胞,通过产生IL-10、IL-35、TGF-β等细胞因子抑制T细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是干细胞的一个分支,具有自我更新和多向分化能力,包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。是目前临床研究中使用最多的干细胞类型,可治疗多发性硬化、类风湿性关节炎等多种免疫性疾病。间充质干细胞主要通过细胞间直接接触作用与旁分泌作用,发挥其免疫调节、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖分化以及血管生成等功能。研究显示健康人和银屑病患者MSCs可以促进Treg淋巴细胞增殖,但与健康人相比,患者MSCs促进Treg淋巴细胞增殖的能力明显减弱,同时,银屑病患者MSCs促进Treg淋巴细胞的转录因子Foxp3及外周血淋巴细胞中IL-10和TGF-β表达能力下降。外泌体（Exosomes,EXO）是细胞分泌的,直径40～100nm的细胞外囊泡,可特异性表达CD9、CD63、CD81,含有多种生物活性分子,如RNA、蛋白质、脂质、酶。它介导细胞通讯,在细胞之间发挥多种生物学功能。mi RNA是一种内源基因编码的非编码单链小RNA,约18～25个核苷酸,已发现在多种癌症和皮肤病中均有异常表达,通过与靶目标m RNA的3′UTR区结合,促使其降解或抑制其翻译,从而参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种生物学调控,尤其是在炎症和衰老等环境因素应激下,可严重影响免疫细胞发育的稳定性。mi RNA是细胞发育和分化、血管生成、凋亡、代谢和信号转导等多种生物学过程的关键调节因子。外泌体中含有丰富的mi RNA,MSCs分泌的外泌体可以携带mi RNA与靶细胞之间进行物质交换和信息交流。mi R-155-5p已被证明在炎症和免疫异常反应中起重要的调节作用,我科研究人员R.X.Hou等先前通过microarray研究表明,银屑病患者皮肤间充质干细胞（MSCs）在炎性细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1（在银屑病中表达明显增高）作用下可诱导其mi R-155-5p的表达上调,同时其靶基因TAB2、i NOS的表达较低,可能在很大程度上影响MSCs的细胞因子表达和免疫调节功能。但与正常人比较,mi R-155-5p是否在银屑病MSCs分泌的外泌体中也同样高表达?银屑病和正常皮肤MSCs分泌的外泌体中存在何种差异mi RNA?能否结合下游靶基因,在银屑病相关的Th17/Treg失衡中发挥作用?本研究旨在阐明银屑病MSCs外泌体中mi RNA靶向调节Th17/Treg的失衡机制,它可能为治疗银屑病提供新的药物治疗靶点。方法:1、从正常人及银屑病患者皮肤组织提取MSCs,分离培养。使用差速离心法,提取银屑病皮损、正常皮肤来源MSCs上清中的外泌体。使用电镜观察、粒径分析及Western-blot检测外泌体表面特征性标记物CD63、TSG101（Calnexin作为阴性对照）,用于鉴定外泌体。用BCA法检测定外泌体浓度。2、将人间充质干细胞外泌体与人T淋巴细胞株共培养,应用流式细胞术检测Th17/Treg的比例,ELISA法检测细胞培养上清中IL-17、IL-23、IL-10、TGF-β含量的变化。3、用RT-q PCR检测外泌体中hsa-mi R-155-5p及外参cel-mi R-39相对含量。对银屑病皮损、正常皮肤MSCs上清中的外泌体进行mi RNA高通量测序,筛选差异mi RNA,选择差异显著的9个mi RNA进行RT-PCR验证,选择差异最显著的mi RNA作为研究目标,通过使用基因本体论（GO）富集分析,将差异表达的mi RNA的预测靶基因分成三个独立的类别,即生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8进行GO富集分析和KEGG分析,并使用STRING 11.5进行PPI分析。利用Target Scan、mi RDB、mi Randa在线工具对29个差异mi RNA进行target gene预测,结果筛选到189个潜在的靶基因,在Pubmed数据库中分别以靶基因和Th17/Treg进行检索,将其中在银屑病研究中存在关联的靶基因筛选出来,同时以mi RNA和Th17/Treg为关键词进行检索,预测出目标mi RNA潜在的靶基因,RT-PCR、Western-blot进一步筛选、验证靶基因。利用双荧光素酶报告基因实验,验证mi RNA与预测靶基因存在结合位点。4、在银屑病皮损来源间充质干细胞中慢病毒转染mi RNA mimics/inhibitor,构建目标mi RNA过表达与低表达细胞系,RT-PCR检测转染效果和靶基因m RNA的转录水平,Western-blot检测靶基因蛋白表达水平的变化;收集mi RNA mimics/inhibitor银屑病MSCs细胞系来源外泌体,将其与人T淋巴细胞共培养,流式细胞术检测Th17/Treg的分化比例,ELISA法检测细胞培养上清中IL-17、IL-23、IL-10、TGF-β含量的变化。5、所有分析均使用SPSS软件（Version20.0,Inc.,Chicago,IL,USA）进行。使用配对t检验比较配对组。实验数据组间统计学差异采用one-way ANOVA和Tukey’s检验,P＜0.05认为有显著性差异。结果:1、MSCs外泌体与T细胞株共培养,流式细胞术检测Th17/Treg的比例。银屑病外泌体共培养组T细胞株向Th17分化增加,向Treg分化减少;ELISA法检测细胞培养物中IL-17、IL-23、IL-10、TGF-β含量的变化,Th17的特异性因子IL-17、IL-23明显升高,Treg的特异性因子IL-10、TGF-β明显降低。2、RT-q PCR检测样本中hsa-mi R-155-5p及外参cel-mi R-39相对含量,外参检测正常,但银屑病与正常皮肤MSCs外泌体样本中hsa-mi R-155-5p无表达。3、通过mi RNA高通量测序和生物信息学分析筛选mi R-183-5p使用Redge R包进行差异分析,对银屑病和正常皮肤MSCs外泌体测序进行差异分析,采用R ggplot2包绘制火山图和热图,显示29种mi RNA在银屑病和正常皮肤MSCs外泌体差异表达（|log FC|＞1＆PValue＜0.05）。热图和火山图显示13种mi RNA上调,16种mi RNA下调。KEGG途径分析显示这些靶基因主要集中在PI3K-AKT、FOXO、MAPK、IL-17途径。GO BP富集分析显示,靶基因主要富集在RNA聚合酶Ⅱ转录调控、凋亡和基因表达的负向调节、细胞凋亡的正向调节等方面。GO CC富集分析显示,靶基因主要富集在细胞核内;GO MF富集分析显示,靶基因主要富集在蛋白结合方面。选取9个与对照组差异超过3倍的mi RNA（mi R-4488、mi R-1246、mi R-1290、mi R-150-5p、mi R-183-5p、mi R-196a-5p、mi R-199a-5p、mi R-200b-5p和mi R-203a-3p）来进行RT-PCR验证,我们发现mi R-183-5p在银屑病外泌体中表达水平明显降低,我们将其作为目标mi RNA进行后续研究,并应用生信分析预测了mi R-183-5p的下游靶基因为SMAD4、FOXO1。4、q RT-PCR和WB检测靶基因SMAD4、FOXO1在正常组和银屑病组T细胞中的表达水平,随着mi R-183-5p下调,FOXO1上调,说明mi R-183-5p与FOXO1存在靶向调控关系。双荧光素酶报告基因检测显示p SICHECK2-FOXO1-WT报告基因的萤火虫-Luc活性被mi R-183-5p-mimic明显抑制（p＜0.05）。银屑病组中mi R-183-5p下调,而SMAD4未上调,SMAD4说明与mi R-183-5p没有靶向调控关系。5、银屑病MSCs外泌体可以通过下调mi R-183-5p,增加FOXO1表达,促进T淋巴细胞株向Th17分化,同时Th17特异性因子IL-17、IL-23表达显著增加,而mi R-183-5p mimics干扰的间充质干细胞分离的外泌体未引起Th17/Treg比例明显变化。结论:1、外泌体对于转运的效应分子,是有选择性的,这种选择性机制决定了外泌体在介导细胞间通讯、信号转导、遗传物质的运输、发挥免疫调节作用等病理生理过程中发挥精细的调控作用。2、银屑病MSCs外泌体与T细胞株共培养,可以引起Th17/Treg分化失衡。3、银屑病MSCs外泌体可以通过下调mi R-183-5p,增加FOXO1表达,mi R-183-5p和FOXO1存在靶向结合关系。4、银屑病患者皮损MSCs外泌体可以通过下调mi R-183-5p,上调FOXO1,促进T淋巴细胞株向Th17分化,加重炎症反应。mi R-183-5p/FOXO1通路并不能够有效促进T淋巴细胞株向Treg分化,还存在其他机制影响Treg分化。