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目的:肌少症是一种以骨骼肌质量和力量的进行性和全身性下降为特征的综合征,其不良后果包括身体残疾、生活质量差以及死亡。肌少症发生的机制是复杂的,其中一个重要的机制是线粒体生物发生的改变。多项研究表明,生长激素（growth hormone,GH）治疗是一种有效的抗衰老疗法,可以改善老年人的肌肉质量减少或肌力下降。有研究表明,GH替代治疗可导致骨骼肌线粒体新生增加。但这种治疗方法因存在一定的副作用一直存在争议。Krüppel-like factor 9（KLF9）是在多数组织中均存在表达的一种转录因子,KLF9已被证明可以调节动物的发育以及细胞的增殖、分化和凋亡。已有研究证实KLF9表达的改变可对心肌线粒体产生影响。但目前尚缺乏KLF9在骨骼肌中的相关研究。为了阐明KLF9对骨骼肌线粒体中的影响,以及GH是否通过KLF9影响骨骼肌中的线粒体的生成和功能,我们进行了一系列相关研究。为今后肌少症的治疗提供新的思路和治疗靶点。研究方法:1.本研究首先以加速衰老（accelerated senescence-prone 8,SAMP8）小鼠为研究对象,对其应用重组人生长激素（recombinant human growth hormone,rh GH）,对照组为抗加速衰老（accelerated senescence-resistant 1,SAMR1）小鼠。共分为三组:SAMR1组（n=6）、SAMP8+Saline组（n=6）、SAMP8+GH组（n=6）。SAMP8+GH组连续应用rh GH（2 mg/kg/天）皮下注射生长激素4周,SAMP8+Saline组应用相同体积的生理盐水。定期测量体重,利用micro CT成像方法检测骨骼肌及骨骼肌内脂肪浸润体积,放射免疫分析法测量血清GH、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）水平,利用跑步耐力测试测量奔跑疲劳时间和距离以评估肌力,腓肠肌HE染色观察肌纤维组织形态变化,透射电镜观察线粒体形态,利用蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）的方法检测腓肠肌中肌肉分化及线粒体新生相关蛋白的表达水平。2.第二部分实验我们以Klf9基因敲除小鼠为研究对象,分为对照组和Klf9基因敲除组两个组,同样对比上述体重、血清GH、IGF-1、肌力、肌纤维组织形态、肌肉分化及线粒体新生相关蛋白的表达的变化。3.第三部分实验中,我们用含有浓度梯度（0、10、20ng/ml）的rh GH的DMEM培养基培养C2C12成肌细胞,用感染慢病毒的方法使C2C12成肌细胞过表达或敲除Klf9基因。用CCK-8法检测C2C12成肌细胞生存率,利用WB的方法检测细胞中肌肉分化及线粒体新生相关蛋白的表达水平的差异,线粒体染色观察线粒体含量,透射电镜观察C2C12成肌细胞中线粒体形态和含量的改变,利用线粒体氧耗实验（seahorse）检测C2C12成肌细胞线粒体有氧呼吸功能的改变。实验结果:1.SAMP8+GH组腓肠肌质量/体重比值以及骨骼肌体积/体重比值与SAMP8+Saline组相比明显升高（P＜0.05）,与SAMR1组相比无明显差异（P＞0.05）。SAMP8+Saline组脂肪浸润体积/骨骼肌体积比值明显高于另外两组（P＜0.05）,SAMP8+GH组脂肪浸润体积/骨骼肌比值与SAMR1组无明显差异（P＞0.05）。与SAMR1组比较,SAMP8+Saline组奔跑至精疲力竭时的时间和距离均明显缩短（P＜0.01）;SAMP8+GH组奔跑至精疲力竭时的时间和距离较SAMP8+Saline组均明显延长（P＜0.05）。SAMR1组及SAMP8+GH组腓肠肌肌纤维排列整齐有序,结构清晰、紧密;SAMP8+Saline组腓肠肌纤维结构松散。SAMP8+Saline组肌纤维横截面积与SAMR1组相比明显缩小（P＜0.01）,SAMP8+GH组与SAMP8+Saline组相比肌纤维横截面积明显增大（P＜0.05）。SAMR1组与SAMP8+GH组的线粒体结构完整,而SAMP8+Saline组粒体形态不规则,且SAMP8+Saline组与SAMR1组（P＜0.01）和SAMP8+GH组（P＜0.05）相比线粒体数量明显减少。WB结果显示,SAMP8+Saline组与SAMR1组相比KLF9、PGC-1α、NRF-1表达明显降低（P＜0.05）,SAMP8+GH组较SAMP8+Saline组KLF9、PGC-1α、NRF-1表达明显升高（P＜0.05）。2.与WT组比较,KO组小鼠奔跑至精疲力竭时的时间和距离均明显缩短（P＜0.01）。其中雄性小鼠WT组和KO组差异更大（P=0.001）。经过体重校正后,KO组骨骼肌体积较WT组明显减小（P＜0.05）,KO组肌内脂肪浸润体积与对应的骨骼肌体积的比值较WT组明显增大（P＜0.05）。WT组小鼠腓肠肌肌纤维排列整齐有序,结构清晰、紧密。KO组小鼠腓肠肌纤维形态不规则,肌纤维排列紊乱,肌纤维间隙扩大。KO组肌纤维横截面积较WT组明显缩小（P＜0.001）。KO组每100μm~2线粒体数量较WT组明显减少（P＜0.01）。WB实验提示,KO组小鼠骨骼肌中myogenin、Myo D、PGC-1α、NRF-1这四种蛋白的水平较WT组均降低（P＜0.05）。3.Klf9过表达的C2C12成肌细胞存活率与对照组相比显著升高（P＜0.001）;Klf9敲除的C2C12成肌细胞与其对照组相比细胞存活率显著下降（P＜0.001）。不同浓度rh GH刺激对C2C12成肌细胞的存活率无明显影响（P＞0.05）。应用GH处理后,分化后的细胞中KLF9、PGC-1α、NRF-1表达升高,且升高的水平存在GH剂量依赖性（P＜0.05）。与对照组相比,过表达和敲除Klf9的细胞中分化相关蛋白myogenin、Myo D的表达水平均降低。PGC-1α、NRF-1的表达水平的变化与KLF9的变化方向一致。Klf9基因敲除的细胞应用GH处理后,PGC-1α、NRF-1的表达无明显变化（P＞0.05）。Klf9过表达的C2C12成肌细胞内线粒体含量明显增多（P＜0.01）,Klf9敲除的C2C12成肌细胞线粒体含量减少（P＜0.001）。GH处理后,正常C2C12成肌细胞内线粒体含量明显增加（P＜0.001）,Klf9敲除的C2C12成肌细胞内线粒体含量未见明显增加（P＞0.05）。Seahorse实验结果显示,Klf9过表达的C2C12成肌细胞线粒体有氧呼吸功能提高;而Klf9敲除的C2C12成肌细胞内线粒体有氧呼吸功能明显降低。C2C12成肌细胞应用GH处理后,线粒体有氧呼吸功能提高;而Klf9敲除的C2C12成肌细胞应用GH处理后,线粒体有氧呼吸功能未见明显提高。结论:应用GH治疗后,衰老小鼠腓肠肌中KLF9表达水平升高,骨骼肌量增加、功能改善,且骨骼肌内线粒体生成增加、结构改善;Klf9基因敲除小鼠骨骼肌量减少、功能下降,并出现骨骼肌内线粒体生成减少、结构受损;在成肌细胞中,GH可以促进KLF9的表达以及促进线粒体生成和线粒体功能,而这种促进作用在Klf9敲除的成肌细胞内消失。因此,GH可能通过诱导KLF9的表达促进线粒体生成和功能,进而改善肌少症。