临床流行病学和病毒学研究表明，在我国，乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝细胞癌（HCC）最重要的病因，HBV复制在肝炎、肝硬化、肝癌的发生和发展过程中、甚至肝癌转移和复发阶段都可能起重要的作用，然而，HBV致HCC的确切机制目前还没有明确。根据HBV全基因序列异质性≥8％的标准，将HBV分为A-H八个基因型，研究发现我国主要的基因型是B型与C型，并发现基因型与病毒变异有一定的依从性，尤其是核心启动子（BCP）变异和前C终止密码子变异（PC）。最近许多研究表明HBV基因型、病毒变异、HBV DNA水平与HCC存在一定的关系，然而还没有统一的观点，甚至出现相反的结论。为进一步研究HBV基因型及病毒变异与HCC发生的确切关系，我们利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）以及部分PCR产物测序的方法对401例慢性HBV感染者，包括112例HCC患者（HCC组），129例无症状携带者（ASC组），70例肝硬化患者（LC组）和90例慢性肝炎患者（CH组）进行HBV基因分型和C基因亚型鉴定，以及BCP和PC变异检测。结果发现401例慢性HBV感染者HBV基因型为B基因型或C基因型感染，未发现其他基因型，HCC组中C型分布高于其他三个疾病组；在HCC病例组中血清纤维化指标的多因素分析提示前胶原Ⅲ肽（PⅢP）水平在C基因型中高于B基因型。对基因型与HBV变异和临床特点作了相关性分析，发现C基因型患者BCP变异多于B基因型；B基因型患者PC变异多于C基因型；同时BCP变异发生率随着病程进展而递增：在HCC组、LC组、CH组和ASC组里的BCP变异阳性率分别为74.1％，50.0％，35.0％，22.4％。对270例患者（HCC 112例，LC 70例，CH 90例）进行HBV亚型鉴定，发现C1有105例（67.7％），C2有50例（33.7％），显示C1在本研究对象中的分布高于C2；对亚型与HBV BCP、PC变异的比较，发现C1亚型带有较高的BCP变异。因此本章研究结果提示HBV C基因型和BCP变异是HCC发生的密切相关因素。近年来，虽然肝癌治疗措施尤其是肝叶切除术已有很大的改进和提高，但肝癌的长期预后仍不佳，其重要的原因是肿瘤的复发或转移率高。据有关资料统计，5年左右肝细胞癌复发超过70％，目前对引起肝癌复发和转移的多种临床危险因素已有一些研究，包括肿瘤本身的相关因素和肝脏功能情况。包括肿瘤大小、是否存在包膜、瘤体本身的血管侵润情况，肝脏功能以及肝叶切除的方式等都会影响肝癌复发和转移的发生率。然而越来越多的证据提示HBV基因型与HCC的发生发展有密切关系并影响着HBV相关性肝病的临床表现和临床结局，在HBV的8个基因型中，东南亚地区主要以B型和C型为主，最近的研究资料以及前面的研究已经证实C基因型较B基因型有较高的HCC发生率和引起更为严重的肝细胞损害，是促进HCC发生的高危因素，然而，HBV基因型与病毒载量对肝细胞癌的预后影响尚未得到深入研究，因此我们继续对前一部分研究对象中112例HCC患者进行追踪观察，探讨HCC治疗后肿瘤复发或转移的危险因素。在明确HBV基因型、病毒变异的基础上，采用实时荧光定量检测试剂盒进行HBV DNA定量测定，结果显示最终进入随访研究的106例HCC患者（在随访过程中6例患者由于以下原因而列出研究范围：4例患者在随访52周后观察资料缺失；2例没有完整的病理资料，因此共106例患者进入最终的前瞻性研究）有69例在手术后或肝动脉栓塞化疗术（TACE）治疗后两年内出现肿瘤的复发或转移，其发生率随着时间的推移而逐渐上升，在20周、40周、60周、80周、100周和130周分别为3.8％，9.4％，18.9％，42.5％，59.4％和65.1％。对基线资料的单因素分析，发现血清高水平GGT、无包膜瘤体、门静脉栓塞形成、较大肝癌、肝硬化、BCP变异、C基因型、HBV DNA水平均与肝细胞癌的高复发率或转移率有关，而年龄、性别、谷丙转氨酶水平、血小板计数、血清白蛋白水平、甲胎蛋白、总胆红素、Child-Pugh分数和治疗手段与肝细胞癌的复发或转移无关。多因素分析显示HBV C基因型和HBV DNA高水平是HBV相关性HCC复发和转移的危险因素。复发或转移率随着HBV DNA水平的上升而增加，在基线HBV DNA水平小于3 log₁₀拷贝／mL的肝细胞癌患者中，肿瘤的复发或转移率为22％，在基线HBV DNA水平大于5 log₁₀拷贝／mL的肝细胞癌患者中，肿瘤的复发或转移率升为80％；在106例HCC患者中B基因型29例，C基因型77例；其中77例C基因型有57例（72.6％）发生肿瘤的复发或转移，29例B基因型有12例（42.4％）发生肿瘤的复发或转移，通过Logistic回归分析，发现基因型C较B基因型有更高的肝癌复发或转移发生率。因此，HBV C基因型和HBV DNA高水平是HBV相关性HCC复发和转移的危险因素，同时对HBV C基因型与HBV DNA的相关性分析显示这两个危险因素之间没有关联，进一步表明HBV C基因型和HBV DNA水平分别是HCC复发和转移的相互独立的危险因素。提示HBV C基因型不仅与HCC的发生有密切关系，同时也影响着肿瘤的复发和转移，因此临床上需要对慢性HBV感染者进行HBV基因型鉴定，以更准确地预测慢性HBV感染的临床结局和评估HCC患者的预后。血清高水平HBV DNA是HBV相关性HCC复发或转移的独立危险因素，提示抗病毒治疗不仅应用于慢性肝炎患者，对HBV相关性肝细胞癌术后进行抗病毒治疗也是非常必要的。在前面两部分的研究中，我们通过401例慢性HBV感染者（包括肝细胞癌患者、肝硬化患者、慢性肝炎患者、无症状携带者）分析了HBV基因型、亚型、病毒变异的情况，发现了HBV C基因型和BCP变异与肝细胞癌的发生与发展有密切关系，C基因型和HBV DNA水平可影响HCC的预后和肿瘤转归，是肝细胞癌变的重要危险因素。由于HBx基因序列覆盖了BCP区域，BCP区的T1762／A1764核苷酸双突变导致X蛋白的第130和131位氨基酸发生改变，同时HBx可通过与细胞因子或蛋白结合而发挥其肝癌变作用，因此，探讨HBx基因对细胞周期蛋白的调控机理为揭示HBV致肝细胞癌变机制提供理论和实验依据。我们通过构建HBV-X基因BCP阳性真核表达载体（HBV-X-BCP⁺）和HBV-X基因BCP阴性真核表达载体（HBV-X-BCP^-），瞬时转染HepG2细胞，Western Blotting鉴定HBx融合蛋白和p21^WAF1／CIP1蛋白的表达，观察BCP变异引起的X蛋白两个氨基酸的变化是否会影响细胞周期蛋白p21^WAF1／CIP1的表达情况，从而明确BCP变异致HCC的发生机制。实验结果显示BCP变异阴性的野生型HBx基因能促进p21^WAF1／CIP1蛋白的表达，而BCP阳性的变异型HBx基因却下调p21^WAF1／CIP1蛋白的表达，提示HBV X基因致肝细胞癌变的重要机制是由于长期的病毒感染导致HBV BCP变异，使HBx基因的两个氨基酸发生变化，致使细胞周期蛋白p21^WAF1／CIP1表达下降，异常细胞迅速增生，受损细胞顺利通过G0-G1期进入DNA合成分裂阶段，细胞对癌基因敏感性增强，异常细胞在无控制的情况下增长，极易出现幼稚细胞的迅速生长，最后发展为恶性肿瘤细胞。