甘露聚糖是一类具有复杂结构的植物多糖,其主链通常是由甘露糖、葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键链接而成的。根据其分支结构的糖单元组成特征,可分为纯甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘聚糖。甘露聚糖具有独特的理化性质,如可吸水成胶、具有一定化学惰性强且生物安全性高,因而广泛应用于食品、制药和纺织工业中。与多糖不同,甘露寡糖具有重要生理活性,如抗肿瘤、调节免疫力、促进细胞分裂等。研究还表明,甘露寡糖的生物活性与糖单元的组成、聚合度的大小等密切相关。甘露聚糖酶是一类糖基水解酶(Glycoside Hydrolases,GHs)的总称,能催化多糖内不同类型糖苷键的降解,从而生成分子量更小的寡糖。相比化学或物理方法,酶法降解甘露聚糖制备寡糖的策略具有因反应条件温和而可控性强、因底物选择性清晰而产物明确等优势。然而,目前市场少见能够制备具有特定结构寡糖片段的工具型β-甘露聚糖酶。因此,深入进行相关的酶学资源开发、分子改造及催化特性的研究成为重要的前期基础。甘露聚糖因结构复杂而需要多种酶,如内切酶、外切酶或糖苷酶的协同作用才能实现较为彻底的降解。其中,内切型β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)可随机切割甘露聚糖主链内部的β-1,4糖苷键,是目前关于甘露聚糖酶的研究热点,主要集中在β-甘露聚糖酶的资源开发、晶体结构以及通过分子改造来改变酶的生化特征的研究。然而,关于β-甘露聚糖酶的底物选择性、多糖底物降解模式、寡糖生成特性,及其与催化机制的关联研究则相对较少,这限制了 β-甘露聚糖酶在如寡糖定向制备、糖链测序等方面的精确应用。海洋来源的火色杆菌属(Flammeovirga sβ.)MY04菌株,能以包括甘露聚糖、琼脂糖、褐藻胶等在内的十余种多糖为唯一碳源进行生长,因此也是一株甘露聚糖酶的资源菌。本文首先对MY04菌株的全基因组进行分子挖掘,获得了两个潜在β-甘露聚糖酶基因man01929和man02066;借助生物信息学的软件分析了Man01929和Man02066的蛋白质序列特征;分别构建表达载体、异源表达并纯化了重组酶,重点比较分析了 β-甘露聚糖酶rMan01929和rMan02066在生化特征、底物选择性、底物(多糖和寡糖)降解模式、产物(寡糖)生成特性等诸多方面的差异,分析了相关的内在联系。本文基于β-甘露聚糖酶Man01929的三维结构模拟,进行了理性设计与定点突变,并通过比较研究,分析了酶的底物选择性、寡糖产物生成特性与蛋白质结构之间的内在关系,探讨了 Man01929及其系列突变体之间可进行不同催化机制类型转变的分子机制。本文主要研究结果如下:1、β-甘露聚糖酶Man01929和Man02066的序列特征、生化特征与酶学特性的比较研究(1)β-甘露聚糖酶Man01929和Man02066的序列特征β-甘露聚糖酶Man01929含有932个氨基酸,理论分子量为103.1kDa,等电点为4.25,且无信号肽。预测Man01929有五个功能模块,N端含一个GH5催化模块,447-585 位氨基酸残基为 Coagulation factor 5/8 C-terminal 模块、595-766位氨基酸含有 2 个 PKD/Chitinase 模块、C 端含有 Carbohydrate-binding module 64(CBM64)和 Secretion system C-terminal sorting domain 两个功能模块。在已鉴定的酶中,Man01929 与来自 Blue Mussel Mytilus edulis的Man5A 的一致性最大,36.79%。系统发育树分析表明Man01929属于GH5家族中10亚家族。β-甘露聚糖酶Man02066含有378个氨基酸,理论分子量为44.1kDa,等电点为5.49,N端1-22位氨基酸残基为Ⅰ型信号肽。Man02066仅含有一个GH26催化模块(Glycoside hydrolase family 26 domain)。在已鉴定的β-甘露聚糖酶中与来自Cellvibrio japonicus的CjMan26C序列一致性最高,为42.82%,系统发育树分析表明Mna02066属于GH26家族。(2)重组酶rMan01929和rMan02066的生化特征重组酶rMan01929降解魔芋葡甘聚糖(KGM)和槐豆胶(LBG)的最适温度分别是40℃C和50℃,最适pH分别是8.0和5.0;重组酶rMan01929具有一定的热稳定性(0-40℃)和较宽的pH耐受性(5.0-10.0);金属离子Co2+加入不同底物的反应液中,对rMan01929的活性有不同的影响,如当底物为KGM时可以促进rMan01929的活性,当底物为LBG是,显著抑制rMan01929的活性。重组酶rMan02066降解KGM和LBG的最适温度均是40℃,最适pH均是6.0;重组酶rMan02066在0-30℃时具有一定的热稳定性,受pH影响较大,不耐酸碱;0-1 M的NaCl对rMan02066有不同程度的促进作用,降解LBG时能显著提高活性,最高可将活性提高至148%。综上,β-甘露聚糖酶Man01929和Man02066生化特征差异较大,且因底物的不同而变化。(3)重组酶rMan01929和rMan02066的催化特性重组酶rMan01929:1)可以降解主链以β-1,4糖苷键链接的KGM和LBG,几乎不能降解瓜尔胶和木聚糖,且最适底物为KGM;2)降解KGM和LGB时均表现为内切模式;3)降解KGM所产系列寡糖终产物片段中的1H-NMR谱图中5.05 ppm化学位移值表明,这些最终寡糖主产物片段的还原端以甘露糖为主;4)最小底物为M4,最小产物为M1;5)具有可变的底物降解模式,且在降解系列纯甘露寡糖底物或还原端被邻氨基苯甲酰胺标记的纯甘露寡糖底物时,从还原端切割糖链产生较小的寡糖产物。重组酶rMan02066与rMan01929有所不同的是:1)降解KGM和LBG时,最终以二糖单元为主产物,在降解KGM时会产生一系列不同大小的寡糖产物,综合考虑后推测是二糖甘露聚糖水解酶,推测产生大量其他寡糖中间产物是由于rMan02066对KGM的活性低以及KGM主链结构中葡萄糖单元存在造成的;2)最小底物为M3,最小产物为M1;3)从多种底物的非还原端,以二糖单元为单位持续外切,直至糖链剩余与底物糖链等摩尔量的单糖或二糖产物。综上,Man01929与Man02066均是β-甘露聚糖酶。其中,Man01929是具有一定热稳定性,广泛的pH耐受性的GH5-F10家族的内切型β-甘露聚糖酶,可用于制备还原端以甘露糖残基为主的寡糖片段,这是该酶的重要新颖特征与应用价值。Man02066是不耐酸碱的GH26家族的二糖外切型β-甘露聚糖酶。2、β-甘露聚糖酶Man01929的定点突变以及催化机制首先以EfMan(PDB号为5y6t)为模板,进行同源建模,获得Man01929的三维结构;然后与甘露六糖(M6)进行分子对接,并借助PyMOL软件分析蛋白质的结构、预测潜在的糖基位点。结果表明:Man01929是典型的(β/a)8TIM桶状结构,属于Clan-A超家族,含有一个开放的催化腔,且催化腔长度约30A,内有六个亚结合位点。Man01929含两个潜在催化位点残基,如Glu172(酸碱催化)和Glu289(亲核催化),以及12个潜在糖基结合位点残基(Asp118、Met119、Asp124、Glu172、Trp182、Trp218、Ser19、Tyr221、Asp263、Glu268、Ile269、Glu323)。为了深入鉴定上述潜在糖基结合位点的具体功能,本文以重组质粒pET30a-Man01929为模板,进一步对催化位点(Glu172、Glu289)以及组成-4(Asp124、Glu323)、-3(Met119、Asp118)、+2(Tyr221、Glu268、Ile269)亚位点的关键氨基酸残基进行了定点突变、异源表达并纯化了蛋白质,比较了突变体酶学性质的变化,探讨了 Man01929的催化机制。结果表明:1)β-甘露聚糖酶Man01929的关键催化位点残基为Glu172(酸碱催化)和Glu289(亲核催化);2)通过分析突变体降解甘露聚糖和甘露寡糖的酶活以及产物的变化,发现 Man01929 的-4(Asp124、Glu323),-3(Met119、Asp118)亚位点的关键氨基酸残基不仅参与了酶与底物的结合,还显著影响酶的底物选择性,推测与酶对底物糖链非还原端的识别密切相关,且参与了酶对半乳甘露聚糖的专一性识别、结合与降解过程;3)突变体酶D118A、D118E以及D124Y降解甘露聚糖时,最终主产物的聚合度变大,表明Man01929的Asp118和Asp124位点对寡糖产物的成分和聚合度有显著影响。4)已有文献报道GH5家族β-甘露聚糖酶的转糖基能力与+2亚位点的色氨酸(Trp)有关,与之不同的是本研究发现:Man01929的-4亚位点的Asp124残基突变为Tyr124时,重组酶突变体兼具显著的糖基水解酶和微弱的糖基转移酶活性,提示该位点残基电子云密度的加大或减小,有助于实现其两种催化机制类型的转换调节。综上,本文系统地比较分析了来源于火色杆菌属Flammeovirga sp.MY04的β甘露聚糖酶Man01929和Man02066的生化特性、酶学特性和催化特性,发现两种酶的生化特性及底物降解模式均受底物结构类型的影响,初步揭示了在参与酶与底物结合的诸多糖基结合位点残基中,负责与底物糖链非还原端结合的糖基结合位点残基对底物的识别、结合与降解具有更加重要的影响,且Man01929可用于制备还原端富含甘露糖的葡甘露寡糖片段,是其重要的工具性价值。本文还初步建立了将GH5家族内切型β-甘露聚糖酶Man01929改造成为糖基转移酶的方法,分析并阐释了潜在的机制调节转换的新机理。本文的研究,可为工具型甘露聚糖酶的资源发掘与分子改造提供一定的理论参考与技术借鉴。