论文部分内容阅读
养羊业是新疆区域的支柱产业,绵羊繁殖力高低是养羊业生产效益及绵羊育种实践中遇到的非常重要课题。产羔率是判断绵羊繁殖性状最重要的指标之一,胚胎附植期是影响绵羊产羔率的重要时期。越来越多证据表明激活转录因子4（activity transcriptation factor 4,ATF4）对哺乳动物生殖起重要调控作用,特别是在胚胎附植过程中。本文研究了ATF4在胚胎附植期绵羊子宫内膜的时空表达模式,ATF4细胞水平的功能验证,ATF4诱导蜕膜化进程中的分子机理,为探讨ATF4在胚胎附植过程中的作用机制提供可靠的实验证据。论文主要研究内容及结论如下:试验一ATF4基因在胚胎附植期与发情周期绵羊子宫内膜的时空表达模式目的:探讨ATF4在绵羊早期妊娠子宫内膜中的表达变化规律和在胚胎附植过程中发挥的作用。方法:手术采集早期妊娠第9 d、13 d、17 d、21 d、25 d母羊及同时间点未妊娠母羊子宫内膜组织（每组6只绵羊,妊娠与未妊娠各3只）,利用Real-time PCR、Western blot法研究ATF4在绵羊子宫内膜中的时空表达模式,采用免疫组化法确认ATF4在绵羊子宫内膜中的定位。结果:ATF4 mRNA和蛋白均在妊娠母羊子宫内膜表达高于未妊娠同时间点母羊（P<0.05）,ATF4 mRNA和蛋白的表达随着附植进行逐渐升高（P<0.05）,表达高峰出现在绵羊妊娠第21d,25d开始下降。ATF4在未妊娠母羊中分布于子宫内膜的腔上皮和腺上皮;在妊娠母羊子宫内膜中除了腔上皮、腺上皮,基质中也有明显的免疫阳性反应。结论:研究结果表明ATF4基因可能在早期胚胎附植中发挥一定作用,并且可能参与了绵羊子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程。试验二绵羊子宫内膜基质细胞的分离、培养及鉴定目的:旨在探讨绵羊子宫内膜基质细胞体外分离培养的方法,为ATF4基因在细胞水平的功能验证奠定基础。方法:选取经产母羊任意一侧子宫角部位,无菌操作处理,手术分离子宫内膜组织于37℃,5%CO2进行原代培养。利用胰酶差速消化法分离纯化出子宫内膜基质细胞;利用波蛋白是基质细胞的特异性表达蛋白这一特征,使用免疫细胞化学方法对基质细胞进行定性检测,采用MTT法绘制绵羊子宫内膜基质细胞的体外生长曲线。结果:运用组织块剪碎法成功建立了能在体外条件下正常传代、生长的绵羊子宫内膜基质细胞。结论:经过分离、培养及鉴定,基质细胞体外模型成功建立,为进行相关功能验证奠定了基础。试验三ATF4在绵羊子宫内膜基质细胞蜕膜化进程中的功能研究第一节ATF4过表达与干扰体系的构建目的:通过构建ATF4过表达及干扰体系,为深入研究ATF4基因的功能奠定基础。方法:克隆ATF4 cDNA全长序列,构建pcDNA3.1（+）-ATF4真核表达载体;针对ATF4基因设计shRNA干扰片段,与pGenesil-1载体构建shRNA表达框,把干扰片段克隆入p Genesil-1载体中,分别命名为pGenesil-ATshRNA196、p Genesil-ATshRNA303、pGenesil-ATsh RNA633。经过菌液PCR检测、酶切鉴定及公司测序验证载体构建是否成功。结果:成功构建了ATF4基因的过表达质粒pcDNA3.1（+）-ATF4及干扰载体。结论:把成功构建的过表达及筛选出的最优干扰质粒转染蜕膜细胞,为深入研究ATF4基因的功能提供了思路。第二节ATF4对绵羊子宫内膜蜕膜化进程的影响目的:旨探讨ATF4过表达及干扰载体对绵羊子宫内膜基质在细胞增殖、凋亡及蜕膜化进程中发挥的调控作用。方法:利用构建成功的ATF4两类载体转染蜕膜细胞（用孕酮、雌二醇及环磷酸腺苷共同诱导）发生,蜕膜细胞转染72 h,运用实时荧光定量PCR及蛋白印迹技术评价其转染相应质粒后产生的增强或抑制ATF4表达的效应,同时用Western blot检测催乳素蛋白的变化。结果:ATF4过表达引起蜕膜细胞中ATF4 mRNA与protein的表达上调,而干扰ATF4能够导致ATF4 mRNA及protein的表达下调（P<0.05）。结论:过表达ATF4抑制绵羊子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程,而干扰ATF4促进了妊娠绵羊子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程。试验四ATF4基因在蜕膜化过程中的分子机理研究目的:寻找ATF4基因在妊娠母羊子宫内膜基质细胞蜕膜化进程的分子机制。方法:Western blot检测绵羊子宫内膜基质细胞诱导蜕膜化后,ATF4-ATF3-CHOP通路上ATF3、CHOP、死亡受体DR4、DR5、caspase-8及Bcl-2蛋白的表达。结果:DR4与DR5蛋白在诱导子宫内膜基质细胞蜕膜化72 h均显著升高（P<0.05）。蜕膜细胞转染ATF4过表达载体72 h,caspase-8 protein表达水平上升,Bcl-2protein表达水平显著降低（P<0.05）。结论:ATF4-pcDNA3.1引起凋亡水平上升,而pGenesil-ATshRNA303则引起凋亡水平降低,据此推断蜕膜细胞ATF4 protein可能是通过ATF4-ATF3-CHOP-DR5信号通路与死亡受体DR5/DR4结合导致pro-caspase-8激活成caspase-8,而Bcl-2 protein下调表达经过线粒体依赖途径引起蜕膜细胞的凋亡。试验五ATF4在绵羊体外受精胚胎及核移植胚胎早期发育不同阶段的表达目的:旨探讨ATF4在早期体外发育胚胎中的表达变化规律,为深入研究ATF4在胚胎发育中的作用提供理论依据。方法:采集卵巢,收集卵母细胞,体外成熟后分别进行体外受精及核移植操作,分别收集2-4 cell,8-16cell,桑葚胚及囊胚阶段的胚胎,用real-time PCR进行mRNA定量表达。结果:RT-PCR荧光定量结果显示,2-4 cell,8-16cell,桑葚胚,随着胚胎的发育,ATF4的表达量逐渐上升,到达囊胚期表达量下降至最低水平。体外受精胚胎与核移植胚胎相比,2-4 cell,8-16 cell,桑葚胚各时期的表达量差异显著（P<0.05）。结论:ATF4在早期胚胎发育中起着十分重要的作用。全文结论:本试验研究了ATF4在绵羊早期妊娠子宫的时空表达规律,结果显示ATF4在妊娠母羊子宫内膜基质细胞中能明显表达,而未妊娠母羊表达不明显。同时验证了ATF4在绵羊子宫内膜基质细胞蜕膜化进程中能够特异表达,且表现一定的规律,雌激素及孕激素对ATF4表达起正向调控作用,ATF4对蜕膜细胞凋亡、蜕膜化产生重要影响,ATF4-ATF3-CHOP-DR5信号通路是主要的调节通路,且通过对凋亡受体DR5的调控引起caspase-8蛋白表达上升及Bcl-2蛋白表达下调,经过线粒体依赖途径诱导蜕膜基质细胞的凋亡。研究结果也表明,ATF4对早期胚胎的发育过程产生一定的作用。