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目的：
1.探讨脱氧胆酸基接枝的壳聚糖衍生物负载姜黄素(Curcumin，Cur)纳米粒(Curcumin/Chitosan-deoxycholic acid，Cur/Chit-DC)的合成方法；2.观察负载异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)的Cur/Chit-DC和Chit-DC纳米粒与人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞间相互作用的过程；3.评价Cur/Chit-DC纳米粒对hRPE细胞的增殖及血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)mRNA表达水平的影响。力图寻找一种新型的、缓释的、安全有效的防治糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的新药物。
方法：
1.Cur/Chit-DC的合成及其性能分析：将Cur与Chit-DC混合制成负载药的壳聚糖衍生物纳米粒；将Cur/Chit-DC纳米粒溶液装入透析袋中并置于透析介质中(含20％乙醇的磷酸盐缓冲液，37.0℃)，每隔一段时间取透析介质1.0ml，采用紫外分光光度法(λ=433nm)测定释放药物的含量，并且计算药物从纳米粒中释放出来的累积释放量。2.hRPE细胞的体外培养和鉴定：中山眼科中心提供的hRPE细胞进行体外培养，用相差显微镜观察，细胞免疫组织化学法鉴定。3.负载荧光染料FITC的Chit-DC及Cur/Chit-DC与hRPE细胞的相互作用：负载荧光染料FITC的Chit-DC及Cur/Chit-DC作用于hRPE细胞24h后，倒置荧光显微镜下观察避光培养1、3、5天后Chit-DC及Cur/Chit-DC与hRPE细胞的相互关系。4.CCK-8比色法评价Chit-DC对hRPE细胞的增殖影响：CCK-8法检测不同剂量(5、10、20、40μg/ml)Chit-DC在不同时间点(24h、48h)对hRPE细胞的增殖影响，评价Chit-DC的生物安全性。5.CCK-8法检测不同剂量(5、10、20、40μg/ml)Cur/Chit-DC和Cur在不同时间点(1、2、3、4、5、6d)对hRPE细胞的增殖影响。6.流式细胞仪测定Cur/Chit-DC及Cur对hRPE细胞周期时相变化。7.半定量RT-PCR分别检测剂量为10μg/ml的Cur、Chit-DC和Cur/Chit-DC作用hRPE细胞24h后细胞VEGF mRNA的表达水平。
结果：
1.通过将Cur与Chit-DC混合制成负载药的壳聚糖衍生物纳米粒为淡黄色；药物从纳米粒中的释放在96h后达到平衡，累积释放药物量为31.6％。
2.体外成功培养hRPE细胞，胞体为不规则多角形，胞内含黑色素颗粒，中央有一圆形透明区为细胞核；随着传代次数的增加，胞浆内的黑色素颗粒逐渐减少，当传至第5～6代时胞浆内的黑色素颗粒基本消失，形状类似成纤维细胞。经免疫化学角蛋白单克隆抗体鉴定呈阳性。
3.不同浓度的Chit-DC纳米粒作用于hRPE细胞24h、48h后与对照组(药物浓度为0mg/L)OD值的差别无统计学意义(P＞0.05)。提示载药材料Chit-DC对hRPE细胞无毒性、安全性良好。
4.负载荧光染料FITC的Chit-DC与hRPE细胞作用1天后，Chit-DC纳米粒大部分仍位于近细胞膜的部位(可能在细胞膜表面，也可能在细胞质中)；第3天，纳米粒逐渐向细胞核会聚，且大部分位于细胞核周围；第5天，可看到Chit-DC纳米粒已进入细胞核，且纳米粒可能在细胞内溶酶体的作用下有部分降解，因此，荧光染料扩散到整个细胞中，在荧光图中可看到细胞的轮廓，且细胞核区域的荧光较强。即随着时间的延长，纳米粒由细胞外进入细胞内并逐渐地降解。Cur/Chit-DC和细胞作用的关系与Chit-DC大致相同。
5.Cur/Chit-DC纳米粒与Cur原药对体外培养的hRPE细胞的增生抑制率存在差别。在二者作用于hRPE细胞中，各浓度组的Cur/Chit-DC纳米粒与Cur原药对hRPE细胞均有抑制作用(与对照组相比P＜0.05，差别具有统计学意义)，且随着药物浓度的增大，作用时间的延长，其抑制率增高，呈剂量和时间依赖性。在二者作用于hRPE细胞的初期(1～4天)，Cur/Chit-DC纳米粒的各浓度组与Cur原药相应浓度组相比，前者对hRPE细胞的抑制率较后者低，统计分析差别具有统计学意义(P＜0.05)。随着对细胞作用时间的进一步延长(5～6)，前者对hRPE细胞的抑制率与后者相当，统计分析差别无统计学意义(P＞0.05)。
6.(剂量为5、10、20、40μg/ml)Cur/Chit-DC纳米粒与Cur原药分别对hRPE细胞作用24h后，均出现G0-G1期细胞百分比上升，S期细胞百分比下降。
7.10μg/ml的Chit-DC、Cur/Chit-DC纳米粒与Cur原药分别对hRPE细胞作用24h后，Chit-DC纳米粒对hRPE细胞的VEGF mRNA水平的表达无影响(与对照组相比，P＞0.05)；而Cur/Chit-DC纳米粒与Cur原药均能下调hRPE细胞的VEGFmRNA水平的表达(与对照组相比，P＜0.05)。
结论：
载药材料Chit-DC具有良好的生物相容性和安全性；通过Chit-DC包载的Cur纳米粒能持续释放出Cur，具有较持久的缓释功能；Cur/Chit-DC纳米粒与Cur原药对体外培养的hRPE细胞均具有抑制作用，并使其VEGF mRNA的表达水平降低；二者对体外培养的hRPE细胞的抑制作用均具有时间和剂量的依赖性，随着作用时间的延长，Cur/Chit-DC纳米粒对hRPE细胞的抑制作用接近并达到Cur原药水平，再次证明了Cur/Chit-DC纳米粒的缓释功能。本实验为进一步偶联特异性VEGF抗体制备靶向载药纳米粒及进行体内动物实验提供了研究基础，为寻找一种新型的、较持久的、安全有效的防治DR的新药物提供了初步的理论依据。
关键性：纳米粒，姜黄素，壳聚糖，视网膜色素上皮细胞，血管内皮细胞生长因子