背景和目的蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是临床最常见的脑血管危急重症之一,主要为颅内动脉瘤破裂所致。随着神经影像和显微手术的进步,动脉瘤破裂出血造成的直接死亡率明显下降,但患者预后不佳,接近50%的幸存者伴有肢体瘫痪、情感或记忆障碍、丧失重新工作和生活自理能力。因此,针对SAH后继发脑损伤的防治变得愈发重要,成为降低致死致残率和改善患者预后的重要因素和研究热点。SAH后继发性脑损伤的机制至今尚未完全阐述清楚。既往研究均着眼于SAH后大血管痉挛上,认为颅内大动脉痉挛是SAH后最严重的并发症。该认识来源于SAH患者的脑血管造影显示其存在颅内大动脉(大于200μm)的缩窄,而SAH患者又会同时出现无法解释的缺血性神经损伤样症状。因此,血管一直以来被认为是引起SAH患者死亡或致残的主要原因。然而,近年来其与SAH后继发性神经功能障碍的关系备受质疑。一项应用选择性内皮素A受体拮抗剂Clazosentan来治疗SAH患者的多中心、随机、安慰剂对照、双盲的临床研究结果显示:Clazosentan能够显著逆转脑血管造影所示的血管痉挛,但并不能改善SAH患者的神经功能预后。事实上,在颅内动脉瘤破裂引起SAH的同时,继发性脑损伤就已经开始发生了。动脉瘤破裂的瞬间,颅内压极速升高,甚至达到与动脉收缩压相同的程度。因此,SAH患者最常见的主诉是“一生中从未有过的剧烈头痛”。动物实验证实,SAH后10分钟内,兴奋性氨基酸释放、神经元凋亡、细胞坏死等病理生理过程已被激活。基于上述临床和实验研究结果,美国John H.Zhang教授将发生在SAH后最初72小时内的脑损伤定义为早期脑损伤(Early Brain Injury,EBI),认为早期脑损伤是影响SAH患者急性期死亡和幸存者后期神经功能缺损的重要因素,也是影响迟发性血管痉挛的重要因素,对早期脑损伤进行干预可明显提高患者生存率和预后。然而,近年来单纯针对神经元进行保护的临床试验均告失败,促使大家在继续研究SAH后神经元损伤的同时,愈加重视颅内各种细胞之间的广泛联系——血管神经网络(vascularneuralnetwork)。该结构包括:内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、神经元以及与之直接相关的毛细血管、血管平滑肌细胞、血管内皮与管周神经纤维联系、颅内微循环及其上下游小动静脉。由于该结构中各种细胞之间存在简单、快速的交流影响机制,所以保护该网络中的其他结构与保护神经元同样重要。血脑屏障(bloodbrainbarrier,bbb)是该网络中最具代表性的神经血管单元(neurovascularunit),主要由内皮细胞及其紧密连接、星形胶质细胞、血管周围的小胶质细胞、基膜、以及周细胞等组成,最终构成一个调节中枢神经系统内环境稳态的细胞屏障,维持脑组织内离子、激素和递质的动态平衡,保护中枢神经系统不受损伤。临床上,sah早期即可产生广泛的全脑水肿,与血脑屏障损伤导致的血管源性水肿密切相关,是导致sah患者早期脑损伤和不良预后的主要因素之一。既往研究证实,血管神经网络中毋庸置疑的存在着血脑屏障自我修复机制;因此,针对sah早期血脑屏障损伤的修复,可能成为未来sah等多种急性神经损伤疾病的可靠治疗靶点。因此,本研究拟在前期工作基础上,针对sah后血管神经网络的关键靶点:神经元和血脑屏障,分别进行干预,探讨sah后早期脑损伤的内在病理生理机制,为临床转化奠定基础。此外,本研究拟进一步探索颅内微循环下游静脉系统在sah后早期脑损伤发生发展中的作用,丰富早期脑损伤理论,为临床sah患者救治提供可靠的新思路。材料与方法1、采用大脑中动脉线穿法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型。2、采用bpv(pic)(0.2mg/kg)对sah模型大鼠进行干预,进而评价其神经功能障碍、脑含水量、伊文氏蓝渗出量、海马神经元死亡情况、以及谷氨酸ampa受体亚基变化。3、在sah术前48小时侧脑室注射frizzled4sirna,sah术后3小时侧脑室注射重组norrin蛋白,进而评价sah出血量、神经功能障碍、脑含水量、伊文氏蓝渗出量,并用westernblot和免疫荧光染色检测norrin及其受体、以及调节蛋白tspan12在调控血脑屏障连接蛋白中的分子作用机制。4、利用脑组织体积、脑组织内血液含量等指标评价sah后大脑血液循环淤积情况,并在sah模型的基础上,观察皮层引流静脉和颈内静脉回流障碍对sah后脑组织的影响。结果1、在sah后,作为pten活性标志的pten-ser380去磷酸化水平,能够被bpv(pic)疗法显著抑制;同时,pten蛋白表达水平较sah+vehicle组亦显著下降。我们同时发现bpv(pic)疗法能够显著改善神经功能预后,对sah后早期脑损伤的各种急性病例改变起保护作用,包括血脑屏障破坏、脑水肿、神经元死亡等。这些神经保护作用于谷氨酸ampa受体亚基调控相关。具体来说,bpv(pic)治疗后细胞膜上谷氨酸glur1亚基蛋白表达下降,谷氨酸glur2亚基和谷氨酸glur3亚基蛋白表达水平升高。这些结果显示:bpv(pic)通过抑制pten对sah后早期脑损伤起到了保护作用。2、sah后内源性norrin蛋白在脑组织中显著增高,波峰分别在sah后12小时及72小时。同时,norrin蛋白发挥作用的一个支持蛋白tspan12也在sah后显著增高,并持续到sah后72小时。重组norrin蛋白能够显著改善sah后神经功能缺损和血脑屏障的破坏,这些神经保护作用与其促进β-catenin从细胞质转移进入细胞核,以及上调occludin,ve-cadherin和zo-1蛋白表达水平有关。进一步研究发现,用小干扰rna抑制其受体frizzled4受体可以逆转重组norrin蛋白疗法的这些保护作用;表现为阻碍β-catenin向细胞核转位并降低occludin,ve-cadherin和zo-1蛋白表达水平。综合分析后我们认为norrin对于sah后血脑屏障损伤起到了保护作用。3、在sah后24小时,血管破裂同侧大脑半球(左侧半球)较右侧大脑半球显著肿胀,且左侧大脑半球内血液含量较假手术组显著升高,而右侧大脑半球与假手术组没有统计学差异。进一步分析显示:左侧大脑半球含血量与肿胀比例呈正相关关系,与大鼠改良garcia神经功能评分呈负相关关系,但与sah出血量评分无直接相关关系。皮层引流静脉阻断后,sah模型大鼠对应引流皮层局部发生明显充血肿胀,而颈内静脉结扎后可见静脉引流区域微小静脉较sah组显著怒张。结论1、bpv(pic)疗法能够减轻sah后早期脑损伤程度,该作用是通过抑制pten进而调控谷氨酸ampa亚基所发挥的。基于bpv(pic)疗法在低浓度下具有高选择性和高效性,能够显著避免毒副作用,它可能会成为治疗sah患者早期脑损伤的一个可靠治疗方法。2、sah后脑组织中内源性norrin蛋白显著增高;外源性重组norrin疗法能够保护血脑屏障完整性并改善神经功能预后,其机制可能与frizzled4受体介导的β-catenin核转位并进一步增强内皮细胞间隙蛋白表达有关。因此,重组Norrin疗法有可能成为改善SAH患者血脑屏障功能的可靠的新选择。3、SAH后脑组织存在循环血流量淤积,损伤同侧大脑半球更为显著;颈部大静脉和皮层引流小静脉回流障碍会加重SAH后脑组织肿胀,进而加重早期脑损伤和神经功能预后。因此,恢复SAH后动静脉系统平衡,对于缓解早期脑损伤至关重要。4、血管神经网络对于维持脑组织稳态起到了关键的作用,SAH后针对血管神经网络的病理生理改变进行针对性保护,可以显著减轻早期脑损伤,并最终改善患者预后。基于血管神经网络进行临床转化医学研究可能对于SAH患者的临床救治提供可靠的新治疗方案。