论文部分内容阅读
生鲜牛肉弱酸的营养环境及其生产过程中酸性减菌剂的残留具有引发沙门氏菌产生诱导耐酸响应（Acid tolerance response,ATR）的风险。ATR的产生能显著提高细菌的耐酸性和毒力,并产生交叉保护效应,导致栅栏因子失效,危害终端消费者的健康。牛胴体尸僵、牛肉成熟过程中的生理变化对沙门氏菌ATR的产生具有潜在的影响,然而其具体机制仍不明确。本研究探究了模拟环境下牛肉低温贮藏过程中沙门氏菌诱导耐酸响应的存在程度及变化规律,同时试图从双组分调控系统（Two-component regulatory system,TCS）及其调控的氨基酸代谢过程探究牛肉中沙门氏菌ATR产生的特有调控机制。以期评估ATR对冷却牛肉的威胁,为企业在产业链中防控细菌ATR的产生提供理论依据。本研究用牛肉浸出液培养基（Meat medium,ME）模拟牛肉的低温贮藏环境,测定了25d内不同ATR状态的沙门氏菌的菌落总数及耐酸性变化。通过RT-qPCR比较了双组分系统正常菌（14028）和PhoP/PhoQ、PmrA/PmrB系统缺失菌（△phoP和△pmrA）的氨基酸代谢相关基因的相对表达量,并测定了各菌株的表观耐酸性,探索了双组分系统对ATR的调控作用及调控路径。以不同离子环境模拟宰后牛肉生化状态,探究了不同离子环境对沙门氏菌耐酸基因表达的影响。主要研究结果如下:利用λRed重组系统能够成功使同源序列长度为50bp的打靶片段与目标基因完成重组,获得能够稳定传代的组分系统突变沙门氏菌△phoP和△pmrA。通过对低温贮藏过程中沙门氏菌耐酸性的测定,发现ATR一旦产生能够显著提升沙门氏菌的耐酸性（P<0.05）,且这种高耐酸特性在低温环境中至少能维持25d。在微酸的ME中,低温的贮藏能够显著降低沙门氏菌存活率及耐酸能力,甚至能够抑制ATR的产生,证实了实际生产中严格遵守低温操作程序的必要性。缺失phoP基因后,沙门氏菌的与精氨酸和赖氨酸代谢有关的adiA、adiY、cadA和cadB基因表达水平下调,与σ因子有关的rpoS基因表达水平上调,说明细菌的强耐酸性与PhoP/PhoQ系统对精氨酸和赖氨酸代谢途径的调控以及对σ因子的反馈调控有关。通过分析正常菌、△phoP和△pmrA的氨基酸脱羧酶编码基因的表达差异以及添加氨基酸实验,发现酸激介质中添加氨基酸能显著提高细菌的耐酸能力（P<0.05）,与此同时,向△phoP和△pmrA实验组中添加氨基酸也能一定程度上提高细菌的耐酸性,但仍低于对照组。这些结果表明沙门氏菌ATR的产生机制是多方面的:1)双组分系统PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB感受到酸信号,通过对下游精氨酸、赖氨酸代谢过程的调控进而对细菌的耐酸性产生正向调控。2)除PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB外,还存在其他双组分系统或氨基酸感应体系帮助细菌耐酸。3)除氨基酸代谢外,仍存在其他作用通路或全局调控因子（如σ因子）利于细菌耐酸,并且部分因子与双组分系统有关。通过比较不同浓度离子信号组合下正常菌和突变菌adiA和cadA基因的表达水平,发现H+与Ca2+对下游adiA基因的表达具有交互作用,而牛肉生产过程中的酸性环境和Ca2+浓度处于促进表达区间,对adiA基因的相对表达量具有显著提升作用（P<0.05）。H+与Ca2+对下游cadA基因的表达无显著交互作用,这提示了沙门氏菌中精氨酸与赖氨酸代谢的两种不同调控机制。