卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,根据美国癌症协会（American Cancer Society,ACS）的最新数据,2022年美国预计新发卵巢癌19880例,因卵巢癌致死数目为12810例,在女性恶性肿瘤致死率中排第五位。其中,最常见的病理类型就是上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）,约占90%。由于卵巢位置隐匿,处于疾病早期的卵巢癌患者往往缺乏特异的体征,故大部分卵巢癌患者确诊时已处于晚期;加之卵巢癌容易通过盆腹腔和淋巴结实现广泛转移,故而EOC的死亡率一直居高不下,5年生存率不足50%。癌症是一种基因疾病,其发生往往是在致癌基因、抑癌基因和DNA修复基因等多种因素相互作用下的结果。因此,从分子水平上揭示卵巢癌发生的潜在机制,从而发现卵巢癌治疗的新靶点,是当前工作中亟待解决的问题。室管膜蛋白相关蛋白1（ependymin-related protein 1,EPDR1）基因位于人类7号染色体短臂上,是一种跨膜蛋白,介导细胞之间以及细胞与外基质之间的黏附作用。近年来,越来越多的证据表明,EPDR1参与了结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌和肝癌的增殖、转移和凋亡等恶性生物学行为的调控。但EPDR1在EOC中的作用尚未见报道。本课题主要探讨EPDR1在EOC组织中的表达情况,以及EPDR1对EOC恶性生物学行为的影响及其机制,为卵巢癌的基因治疗提供新的理论依据。课题的研究内容主要包括以下3个部分:一、EPDR1在EOC中的表达及临床意义;二、EPDR1对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制;三、EPDR1上游调控机制研究。第一部分:EPDR1在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义研究目的:探究EPDR1在EOC组织中的表达情况以及与临床病理学参数和预后的关系。研究方法:使用R语言下载并分析GEO数据库中的数据集（GSE14407和GSE18520）、TCGA数据库和GTEx数据库以及CPTAC数据库中EPDR1 mRNA和蛋白质在正常卵巢组织和EOC组织中的表达水平区别,通过qRT-PCR的方法检测30例EOC组织和9例正常卵巢组织中EPDR1 mRNA水平的表达,并借助Western blot方法检测8对EOC组织和正常卵巢组织中EPDR1蛋白质水平的表达差异。使用K-M Plotter数据库网站分析EPDR1与EOC预后的关系,通过免疫组化的方法检测EPDR1在184例EOC组织样本中的表达情况,并且分析其与临床病理学特征以及预后的关系。研究结果1.EPDR1在卵巢癌组织中低表达GEO数据库（GSE14407,GSE18520）、TCGA和GTEx数据库以及CPTAC数据库中的数据显示,EPDR1在卵巢癌中的mRNA和蛋白质表达水平都明显降低。qRT-PCR结果表明正常卵巢组织中EPDR1 mRNA的表达量明显高于EOC组织。Western blot的结果与qRT-PCR的结果趋势一致。2.EPDR1的表达水平与卵巢癌患者的FIGO分期和转移情况相关通过对184例EOC组织的免疫组化染色结果分析显示,EPDR1的表达水平与EOC患者的FIGO分期、是否淋巴结转移和是否远处转移显著相关,而不同年龄、不同组织学类型和不同肿瘤大小的患者中EPDR1的表达水平无统计学差异。3.EPDR1的低表达与卵巢癌患者不良预后相关K-M Plotter数据库分析EPDR1与卵巢癌临床预后关系显示EPDR1低表达的卵巢癌患者预后不良。对184例EOC组织进行生存分析提示,EPDR1高表达组的总生存期明显改善。研究结论EPDR1在EOC组织中呈现低表达,并且与卵巢癌的淋巴结转、FIGO分期和远处转移和不良预后相关,可以作为判断EOC结局的指标。第二部分:EPDR1对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制研究目的:探究EPDR1在体内和体外条件下对卵巢癌细胞系增殖、迁移、侵袭能力以及上皮间质转化过程的影响,并探讨其可能的机制。研究方法:构建EPDR1过表达和敲低细胞系,CCK8、克隆形成和EdU实验检测EPDR1对卵巢癌细胞增殖速率和DNA复制能力的作用;划痕实验判断EPDR1对卵巢癌细胞迁移能力的作用;铺基质胶的Transwell侵袭实验观察EPDR1对于卵巢癌细胞侵袭能力的作用。通过Western blot、qRT-PCR和细胞免疫荧光检测EPDR1对卵巢癌细胞上皮间质转化的影响。同时,将稳定过表达EPDR1的卵巢癌细胞系和对照细胞系通过皮下和腹腔注射到裸鼠体内,观察在体内条件下EPDR1对卵巢癌细胞增殖和转移能力的改变。将稳定过表达EPDR1的A2780细胞和对照细胞进行转录组测序,结果显示过表达EPDR1后引起了 PI3K/AKT通路的变化,通过Western blot检测过表达和敲低EPDR1后PI3K/AKT通路相关蛋白的表达情况,并对过表达EPDR1的细胞应用AKT激活剂SC79,通过Western blot检测PI3K/AKT通路关键蛋白AKT,p-AKT,mTOR和p-mTOR的表达情况,并通过EdU增殖实验、划痕实验和Transwell实验观察卵巢癌细胞DNA复制能力、迁移和侵袭能力的变化,探究EPDR1影响卵巢癌恶性生物学行为的可能机制。研究结果:1.构建EPDR1过表达和敲低细胞系通过qRT-PCR和Western blot检测不同卵巢癌细胞系（A2780,SKOV3,HEY,HO-8910）中EPDR1的本底表达量,选择低表达EPDR1的卵巢癌细胞系A2780和HEY进行慢病毒转染,构建稳定过表达EPDR1的卵巢癌细胞系;选择高表达EPDR1的卵巢癌细胞系SKOV3转染EPDR1小干扰,构建EPDR1低表达的卵巢癌细胞系,并通过qRT-PCR和Western blot检测过表达和敲低效率,结果显示,过表达慢病毒和两条小干扰序列能够显著分别提高和降低EPDR1在卵巢癌细胞系中的表达。2.在体外条件下EPDR1抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力CCK8,克隆形成和EdU实验结果表明,过表达EPDR1后,卵巢癌细胞的增殖速率显著降低。与此同时,划痕实验和带有基质胶的Transwell侵袭实验结果显示,过表达EPDR1能够抑制卵巢癌细胞系的迁移和侵袭能力。而敲低EPDR1则提高了卵巢癌细胞的增殖和转移能力。和qRT-PCR结果一致,Western blot的结果显示,过表达EPDR1后,上皮性标志物E-粘钙蛋白的表达量提高,而间质性标志物N-粘钙蛋白和波形蛋白的表达量降低,在SKOV3细胞中,敲低EPDR1后出现了相反的结果。3.在体内条件下EPDR1抑制卵巢癌细胞增殖和转移能力裸鼠皮下成瘤结果显示,与对照组相比,EPDR1过表达组的肿瘤生长速度较慢,并且肿瘤体积显著减小。裸鼠腹腔种植转移模型实验结果显示,过表达EPDR1后,卵巢癌细胞的腹腔转移能力降低。4.EPDR1在卵巢癌细胞中通过PI3K/AKT通路发挥作用对转录组测序结果进行KEGG富集分析显示,过表达EPDR1能够引起PI3K/AKT通路的变化,Western blot结果显示,过表达EPDR1后,PI3K/AKT通路中PI3K,p-AKT和p-mTOR的表达降低,对过表达EPDR1的细胞应用AKT激活剂SC79后,p-AKT和p-mTOR的表达升高,并且EPDR1对于卵巢癌细胞恶性表型抑制作用被减弱。研究结论:EPDR1能够通过抑制PI3K/AKT通路抑制卵巢癌的恶性表型。第三部分:EPDR1上游调控机制研究研究目的:探究EPDR1在卵巢癌中的表达调控机制。研究方法:通过Starbase数据库预测可能与EPDR1结合的miRNA及其结合位点,通过GEO数据库（GSE47841）筛选在卵巢癌组织中高表达的miRNA,将两者取交集预测出可能在卵巢癌中抑制EPDR1表达的miRNA。在卵巢癌细胞中过表达候选的miRNA后通过qRT-PCR检测EPDR1的表达情况,确定能够真正调控EPDR1表达的miRNA。通过qRT-PCR技术检测miR-429在30例EOC组织和9例正常卵巢上皮组织中的差异表达情况。在30例EOC组织中通过qRT-PCR检测miR-429和EPDR1的表达情况,分析二者表达的相关性。随后,通过qRT-PCR和Western blot检测转染miR-429模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）后卵巢癌细胞中EPDR1 mRNA和蛋白质水平的表达情况。构建突变型和野生型的EPDR1的3’UTR荧光素酶表达质粒pGL3-EPDR1,与miR-429的mimic共转染至HEK-293T细胞和HEY细胞,通过双荧光素酶实验验证miR-429与EPDR1之间存在直接结合的关系,最后,通过体外的挽救实验证明EPDR1对于卵巢癌细胞恶性生物学行为的抑制同样受到miR-429的调控。研究结果:1.miR-429是EPDR1的上游调控因子将从Starbase数据库中预测的结果与从GEO数据库（GSE47841）中预测的结果取交集,我们获得了三个候选miRNA:miR-429、miR-422a和miR-421。qRT-PCR检测卵巢癌细胞转染这三个候选miRNA mimics后EPDR1的表达情况,确定只有转染miR-429后EPDR1的表达明显降低。qRT-RCR检测卵巢癌组织中miR-429的表达结果显示,与正常卵巢上皮组织相比,miR-429在EOC组织中表达较高且与EPDR1的表达呈现负相关。qRT-PCR和Western blot检测在转染miR-429后EPDR1的mRNA和蛋白质的表达量降低。2.EPDR1是miR-429的直接作用靶点双荧光素酶报告实验结果显示,在HEY细胞和HEK-293T细胞中,阴性对照对照组共转染组的荧光强度明显高于miR-429 mimic和野生型pGL3-EPDR1质粒共转染组。对于突变型载体pGL3-EPDR1,两组之间的荧光强度没有明显差别。3.EPDR1对卵巢癌的抑制作用受到miR-429的调控进行体外细胞表型功能的挽救实验,结果显示,miR-429的过表达能够逆转EPDR1过表达所导致的卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的减弱以及对PI3K/AKT通路的抑制作用。研究结论:EPDR1在卵巢癌中的表达和功能均受到miR-429的抑制。本研究的创新之处1.首次证实EPDR1低表达与EOC患者预后不良相关。2.首次证实EPDR1能够通过PI3K/AKT通路抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移,为卵巢癌患者的个性化治疗提供新靶点。3.首次揭示EPDR1的表达和功能受到miR-429的直接调控。本研究的不足之处1.本研究未能探讨EPDR1如何通过PI3K/AKT通路发挥作用。2.本研究未能探讨EPDR1对卵巢癌细胞血管生成和耐药等其他生物学行为的影响。