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植物病毒病是仅次于植物真菌病害的第二大植物病害,给农业生产造成了严重的经济损失。生物农药由于残留量低、对环境安全、对非靶标生物安全、不易产生耐药性等优点,受到越来越多的关注并且展现出很好的发展潜力,从自然界有益微生物中分离和鉴定更安全、更有效的抗病毒代谢产物成为目前的研究热点。本研究筛选对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）具有显著抑制作用及对植物具有促生长作用的多功能生防细菌,分离纯化抗病毒活性物质,克隆其编码基因,通过原核表达获得纯化的重组蛋白,并从对寄主的诱导抗性和对TMV的抑制作用两个方面解析其抗病毒作用机制,为抗病毒微生物农药的创制提供理论依据。本研究取得以下研究结果:1.筛选获得抗植物病毒、促进植物生长的多功能生防菌B8。本试验采用“杯碟法”从23株细菌中筛选出8株对蜡状芽孢杆菌具有抑制效果的生防菌,研究了其中7株的无菌发酵液对蜡状芽孢杆菌和TMV的抑制效果及促进番茄生长作用,结果表明菌株B8发酵液能有效抑制蜡状芽孢杆菌,发酵液与TMV体外混合后接种心叶烟,枯斑抑制率为87.52%;菌株B8无菌发酵液喷施烟草NC89,对TMV的预防作用和治疗作用分别为62.40%和58.91%;其抗菌蛋白粗提物与TMV混合后接种心叶烟,对TMV的抑制率为42.50%;用发酵液稀释20倍液处理番茄种子能促进番茄幼苗生长。2.完成了侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）B8抗TMV活性蛋白的分离鉴定。本试验通过硫酸铵沉淀、薄层层析、SepHadex LH-20柱层析以及高效液相色谱的方法分离得到对TMV侵染具有抑制作用的组分。该蛋白分子量大小约为12.8 kDa,经过质谱分析,该蛋白为一种未知功能的蛋白,命名为BLB8。进一步分析表明BLB8信号肽区域预测为1-30位氨基酸。BLB8处理可以引起烟草的过敏反应（hypersensitive response,HR）。3.开展了BLB8的基因克隆、原核表达及重组蛋白的纯化。本试验根据纯化的BLB8质谱鉴定结果,从侧孢短芽孢杆菌B8中克隆了编码基因blb8,并成功构建了原核表达载体pCold-SUMO-blb8,采用IPTG诱导,大肠杆菌原核表达SUMO-BLB8融合蛋白,使用SUMO蛋白酶对SUMO-BLB8融合蛋白进行酶切,得到了纯化的重组蛋白BLB8。4.初步明确了抗病毒蛋白BLB8抑制TMV的作用机理。本研究通过多种方法验证了重组蛋白BLB8抑制TMV的活性及作用机理。半叶法结果表明,当重组蛋白BLB8浓度为200μg·mL-1时,在心叶烟上对TMV的钝化效果达到了83%,对TMV的预防效果和治疗效果分别为63.83%和55.21%;瞬时表达的BLB8在烟草叶片中对TMV的抑制率约为76%;浸润试验表明,BLB8可以在植物叶片内有效的抑制TMV的增殖和扩散,而且可以引起烟草植株对TMV侵染的系统抗性,接种TMV的烟草在第5 d时,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示TMV外壳蛋白（coat protein,CP）的转录水平较对照处理降低了3倍,且顶端新叶仅表现为轻度畸形。使用激光共聚焦显微镜（Confocal）观察结果表明,BLB8与TMV的CP蛋白可能共定位于烟草质膜上,而透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）的观察结果显示经BLB8孵育后TMV病毒粒子发生断裂,表明BLB8可以破坏TMV粒子的形态。5.初步明确了BLB8蛋白诱导烟草抗TMV的作用机理。研究表明天然和重组BLB8都可以诱导烟草的HR反应。BLB8浸润叶片中的HR标记基因HSR203J被大量诱导,且诱导了活性氧（reactive oxygen species,ROS）信号的产生,重组BLB8引起烟草叶片产生HR反应的最低浓度为100μg·mL-1。通过RT-qPCR检测BLB8浸润烟草叶片中防御相关基因的表达,结果表明,BLB8主要通过激活水杨酸（Salicylic acid,SA）信号通路触发免疫应答。通过转录组分析共获得242个差异表达基因（differential expression genes,DEGs）,其中231个基因表达上调,11个基因表达下调。在BLB8诱导的防御反应中,植物对逆境的响应、防御反应和植物与病原菌相互作用的相关基因发生了上调表达,这些基因涉及激素信号、转录因子和防御反应基因。根据GO富集分析,BLB8处理组的DEGs主要富集在催化活性、结合以及代谢和细胞处理等分子功能。此外,共有52个DEGs被注释到20个不同的KEGG通路。我们推测BLB8主要通过SA信号通路诱导植株产生对TMV的抗性机制。