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南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）是具有α/β水解酶折叠的丝氨酸水解酶。因其出色的催化性能,在食品、化工、能源等行业具有广泛的应用。然而野生型CALB较差的热稳定性使其在实际的生产应用中受到限制。为提高CALB的热稳定性,拓展CALB在工业中的应用,本论文采用理性设计结合固定化策略改造CALB,成功提高了CALB的热稳定性。此外,通过补料分批发酵,成功提高了CALB于毕赤酵母中的表达量。具体包括:（1）根据软件PoPMuSiC和FoldX计算各个位点突变后自由能的变化,以及氨基酸残基的空间位置,选择CALB潜在的热稳定性突变位点。经实验验证,突变位点A146G、A151P和L278M均能有效提高CALB的热稳定性。将这3个点突变进行组合后,组合突变体的热稳定性得到了进一步的提高,其中A146G-L278M在50°C的半衰期t1/2为6.28 h,是野生型的1.35倍,Tm值提高了3.3°C,最适反应温度为50°C,比野生型提高了5°C,比活为野生型的2倍,动力学参数测定表明其在酯合成反应中对己酸的催化效率kcat/Km是野生型的4.1倍。（2）将软件MODIP和BridgeD预测的二硫键T180C-A240C引入突变体A146G-L278M,获得突变体CALB-4X。CALB-4X在50°C的半衰期t1/2为121 h,是野生型的26倍,Tm值提高了4.0°C,最适反应温度比野生型提高了5°C,动力学参数测定表明其在酯合成反应中对己酸的催化效率kcat/Km是野生型的3.8倍,抑制常数Ki表明乙醇对野生型具有更强的抑制作用。（3）解析耐热突变体热稳定性提高的机制。通过分子动力学模拟分析,可知突变体A146G-L278M和CALB-4X蛋白质分子整体的RMSD变化幅度低于野生型,表明突变后蛋白分子主链Cα原子的偏移幅度有所下降,蛋白结构具有更好的稳定性。突变体和野生型的RMSF总体上相差不大,表明突变并未对CALB的整体结构造成太大的影响。（4）采用介孔氧化硅材料固定化突变体CALB-4X,每1 g材料的蛋白负载量可达到98.8 mg,固定化产率为47%,酶活力回收率达到80%。固定化酶MCFs-C8-CALB-4X在50°C下的半衰期为481 h,分别是游离酶CALB-4X和野生型的4倍和103倍。相比游离酶,固定化酶在60°C下酶活更高。此外,固定化酶具有良好的重复使用性,连续使用6次后,仍能保留77%的酶活。（5）采用补料分批发酵提高耐热突变体在毕赤酵母中的表达量。在3 L发酵罐中,突变菌株GS115-calb-A146G-L278M和CALB-4X的发酵酶活分别可达到582和542U·mL-1,分别是野生型的2.5和2.4倍,胞外蛋白量分别可达到2.4和2.5 mg·mL-1。