慢性肾衰竭（CRF）是常见的临床综合征，它发生在各种慢性肾脏病的基础上，缓慢地出现肾功能减退而至衰竭。近年来我国慢性肾衰竭的发病率随着社会老龄化，高血压病、糖尿病等疾病的逐年增多，而呈现出明显上升的趋势。慢性肾衰竭属临床难治性疾病，大部分病人最后往往发展为尿毒症而需要依赖透析生存或进行肾移植。因此，在慢性肾衰竭进展至终末期肾衰竭（尿毒症）之前，采取有效的措施延缓其病程进展，具有重要的意义。肾纤维化是各种肾脏疾病发展到慢性肾衰竭的共同途径，包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化，是各种肾脏病终末期的基本病理变化。肾纤维化同其他器官纤维化一样一直是世界医学的研究热点问题之一。肾小管间质损伤在肾脏病的进展过程中起重要作用，肾小球病变程度相同的患者，如果肾小管病变程度不同，预后可相差很大。肾间质纤维化是指细胞外基质，主要是Ⅰ型、Ⅲ型胶原的增加和沉积，其主要病理表现是肾小管上皮细胞减少和间质中出现大量肌成纤维细胞。肌成纤维细胞能合成及分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原，促进肾间质纤维化的发生，在肾间质纤维化的进程中起重要作用。由于Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的增生是形成肾间质纤维化的重要因素，因此抑制其增生和促进其降解是防治肾间质纤维化的重要途径。临床研究表明，中医药在延缓慢性肾衰竭病程的进展、改善患者预后等方面的作用具有其独特的优势。大量的实验研究也表明，中药具有良好的抗肾纤维化作用。真武汤出自张仲景《伤寒论》，是治疗慢性肾衰竭脾肾阳虚证的主要代表方剂，临床运用较多。本文借助常用的6种中国期刊文献数据库和Pubmed检索系统，并结合手工检索，查出57年来（1949年～2006年）国内期刊发表的有关运用真武汤防治慢性肾衰竭的文献132篇。通过分析57年来真武汤防治慢性肾衰竭的研究文献发现：从50年代以来对真武汤防治慢性肾衰竭的研究一直持续不断，80年代以后研究逐渐增多；研究内容以临床研究为主，有91篇文献，其中运用真武汤加减方研究的有88篇，另有3篇报道采用真武汤原方治疗取得较好的疗效。实验研究报道较少，仅有7篇文献，有以整体动物实验方法观察真武汤加减方改善大鼠慢性肾衰竭模型肾功能的作用，有运用血清药理学方法观察真武汤含药血清对肾小球系膜细胞增殖的影响以及对人胎肾小球系膜细胞外基质成分中纤维连结蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的作用。但尚未见真武汤原方防治慢性肾衰竭的整体动物实验研究及其抗肾间质纤维化作用的报道。1实验目的采用符合中医脾肾阳虚证候特征的慢性肾衰竭病证结合模型，观察真武汤对实验性慢性肾衰竭大鼠肾脏的保护作用，并初步探讨真武汤抗肾间质纤维化的作用以及对肾间质纤维化大鼠肾脏Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的影响。2材料与方法2．1实验动物Wistar雄性健康大鼠65只，6周龄，清洁级，体重200±20g。2．2实验药物2．2．1造模药物：腺嘌呤购自北京化学试剂公司，进口分装（批号：04022），用前将其加入蒸馏水中配制成20mg／ml的混悬液。2．2．2治疗药物：真武汤的组方和剂量参考全国高等医药院校教材《方剂学》（第5版），即炮附片9g、茯苓9g、白芍9g、白术6g、生姜9g，将此剂量设为正常成人60kg体重的1日剂量，再根据文献的方法进行大鼠用药剂量的换算，以正常人60kg体重用药剂量的3.5倍为小剂量，正常人60kg体重用药剂量的14倍为大剂量。饮片购自北京同仁堂饮片有限责任公司，由中国中医科学院望京医院药剂科制备成含生药量为0.245g／ml的小剂量浓缩液和含生药量为0.98g／ml的大剂量浓缩液。2．2．3阳性对照药物：尿毒清颗粒，由广州康臣药业有限公司生产（批号：200602），根据文献，大鼠使用尿毒清治疗慢性肾衰竭的剂量为3.75g／kg。使用时将尿毒清颗粒以蒸馏水配制成含药量为375mg／ml的溶液。2．3模型制作方法采用“单肾切除加腺嘌呤灌胃法”建立大鼠慢性肾衰竭模型。大鼠行左肾切除术1周后，每天以200mg·kg^-1·d^-1剂量的腺嘌呤混悬液灌胃造模，连续28天。2．4随机分组方法65只大鼠根据体重按随机数字表法随机抽取10只作为正常组，10只作为假手术组，45只行左肾全切术。术中及术后1周死亡大鼠5只，术后1周，将存活的40只大鼠根据体重按随机数字表法随机分为模型组10只、真武汤小剂量组10只、真武汤大剂量组10只、尿毒清组10只。2．5给药方法正常组、假手术组、模型组：于分组当天开始每天灌胃2ml蒸馏水，直至第28天。治疗各组于术后分组当天开始，每天灌胃给药直至第28天。尿毒清组按3.75g·kg^-1·d^-1的剂量给尿毒清溶液，真武汤大剂量组按9.8g·kg^-1·d^-1的剂量给真武汤大剂量浓缩液，真武汤小剂量组按2.45g·kg^-1·d^-1的剂量给真武汤小剂量浓缩液。各组大鼠按每周体重情况，调整给药和蒸馏水的量。2．6观察指标及测定方法2．6．1一般情况：体重、大便、体毛、毛泽、精神状态、活动状况、摄食量、饮水量。2．6．2 24h尿量及24h尿蛋白定量：实验分组后每隔7天将大鼠分置于代谢笼内留取上午9时至次日上午9时的24h尿液，留尿期间禁食不禁水。记录24h尿量，并用考马斯亮蓝法测24h尿蛋白定量。2．6．3血常规和血生化：给药4周后，用10％水合氯醛（0.15ml／100g）腹腔注射麻醉，从股动脉抽取血样。红细胞、血红蛋白，用血常规分析仪测定；血肌酐、尿素氮、血钙、血磷，用全自动生化分析仪测定。2．6．4肾脏大体观察：用精密电子天平称单肾湿重，并计算大鼠单侧肾重／体重×10³的值，肉眼观察肾脏大小、形态、颜色、质地、包膜、皮质、髓质等。2．6．5病理染色方法：肾脏石蜡切片，分别进行苏木素伊红（HE）染色、六胺银（PASM）染色、马松（Masson）染色、天狼星红（Sirius Red）染色、Mallory染色，光镜下观察大鼠肾组织5种染色的病理形态学改变。2．6．6肾小管间质病变半定量分析方法：根据Sergio的半定量分级标准，随机选取HE染色每组镜下的20个视野，进行半定量分析。2．6．7肾脏组织病理学图像分析方法：在每组PASM染色切片包含肾小球的区域，随机选取200倍光镜下10个视野，用MetaMorph图像分析系统对所选取视野中PASM染色肾小球系膜阳性目标光密度值进行测定，分别计算每组PASM染色肾小球系膜阳性目标积分光密度，再进行统计分析，以反映肾小球系膜增生程度。每组Masson染色切片在光镜200倍视野下分别观察10个互不重叠的皮质视野，借助HMIAS—2000高清晰彩色病理图文报告分析系统拍照，计算纤维化的面积（每张切片测量10个视野，取平均值）占整个视野间质面积（排除肾小球、肾小管、血管所占面积）的百分比值。在偏振光显微镜200倍视野下，观察天狼星红染色各组切片10个互不重叠的皮质视野中的Ⅰ和Ⅲ型胶原，并采用OLYMPUS—DP60高清晰彩色病理图象分析系统分析、计算Ⅰ、Ⅲ型胶原占整个间质视野的百分比值。2．7统计学方法：应用SPSS（V 15.0）统计软件进行统计学处理分析。所有计量资料以均数±标准差（（?）±s）表示，不同组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较用LSD检验法，方差不齐时采用秩和检验。等级资料的比较采用秩和检验。P值＜0.05认为差异有显著性意义；P值＜0.01认为差异有非常显著性意义。3实验结果3．1一般情况：造模1周后，模型组大鼠开始出现体重下降、生长抑制现象，同时出现体毛干枯发黄不齐、易脱落，畏寒拱背，精神萎靡，活动减少，尾部及耳廓苍白，便稀等脾肾阳虚的症状，各治疗组的体重下降，轻于正常组，但比模型组重，一般情况的表现均较模型组为轻，但不如正常组、假手术组大鼠健康。3．2 24h尿量和24h尿蛋白定量情况：真武汤大剂量组、真武汤小剂量组24h尿量较模型组增加，其中以真武汤大剂量组增加最显著。真武汤大剂量组、真武汤小剂量组24h尿蛋白定量较模型组显著减少，P＜0.05，且以大剂量组作用为最佳。3．3红细胞数、血红蛋白情况：尿毒清组、真武汤大剂量组红细胞数比模型组显著升高，P＜0.05，而治疗各组之间红细胞数比较，P＞0.05，无显著差异；模型组及治疗各组血红蛋白比正常组显著降低，P＜0.05，治疗各组血红蛋白比模型组显著升高，P＜0.05，其中以真武汤大剂量组最明显，但治疗各组之间血红蛋白比较，P＞0.05，无显著差异。3．4血清肌酐、尿素氮、钙、磷情况：治疗各组SCr较模型组显著降低，P＜0.05；尿毒清组、真武汤大剂量组BUN比模型组显著降低，P＜0.05，而真武汤小剂量组BUN较模型组无明显差异；真武汤大剂量组、真武汤小剂量组血钙比模型组升高，P＜0.05，而尿毒清组血钙较模型组无明显差异；治疗各组血磷较模型组显著降低，P＜0.05；其中以真武汤大剂量组的作用最明显。3．5肾脏大体观察情况：模型组右肾明显增大，苍白色，质地坚硬无光泽，皮质明显变薄、皮髓质分界不清，包膜增厚。真武汤大、小剂量组右肾轻度增大，浅褐色，质地较硬无光泽，皮质变薄、皮髓质分界线可辨，包膜增厚。尿毒清组右肾轻度增大，浅褐色，质地较硬无光泽，皮质变薄、皮髓质分界不清，包膜增厚。3．6单侧肾重及单侧肾重／体重×10³情况：大鼠单侧肾重结果显示：①模型组及治疗各组比正常组、假手术组明显增加，P＜0.05；②真武汤大剂量组比模型组显著减轻，P＜0.05，而尿毒清组、真武汤小剂量组与模型组比较，P＞0.05，无显著差异；③真武汤大剂量组比尿毒清组显著减轻，P＜0.05。大鼠单侧肾重／体重×10³结果显示：①模型组及治疗各组比正常组、假手术组明显增加，P＜0.05；②真武汤大剂量组比模型组显著减轻，P＜0.05，而尿毒清组、真武汤小剂量组与模型组比较，P＞0.05，无显著差异；③真武汤大剂量组比尿毒清组显著减轻，P＜0.05。3．7光镜下肾组织病理学情况：正常组和假手术组大鼠的肾小球、肾小管结构正常。模型组大量肾小管上皮细胞凋亡、坏死、脱落或空泡样变性，肾小管高度扩张，肾小管内、肾间质中有大量金黄色的嘌呤代谢产物结晶沉积、可见大量炎细胞浸润，肾间质重度纤维化增生，肾小囊腔扩张，肾小球系膜细胞轻度增生。尿毒清组肾小管轻度扩张、有少量金黄色的嘌呤代谢产物结晶，肾小管上皮细胞轻度空泡样变性，肾间质轻度纤维化，肾间质可见少量炎细胞浸润，肾小囊腔扩张，肾小球系膜细胞轻度增生。真武汤小剂量组肾小管中度扩张，并且有肾小管萎缩，肾小管上皮细胞坏死、脱落，肾小管内、肾间质中有少量金黄色的嘌呤代谢产物结晶沉积，肾间质中度纤维化，肾小囊腔扩张，肾小球系膜细胞轻度增生。真武汤大剂量组有少量肾小管呈中度扩张，肾间质轻度纤维化，肾小管内、肾间质中有少量金黄色的嘌呤代谢产物结晶，肾小囊腔轻度扩张，肾小球系膜细胞增生不明显。3．8肾小管间质病变半定量分级情况：尿毒清组、真武汤小剂量组、真武汤大剂量组的肾小管间质损害较模型组轻，P＜0.01；而真武汤大剂量组与尿毒清组的肾小管间质损害比较接近，P=0.05，且比真武汤小剂量组的肾小管间质损害要轻，P＜0.05。3．9 PASM染色肾小球系膜积分光密度值定量情况：模型组系膜增生最明显，阳性目标积分光密度值最大，与正常组比较，有显著差异，P＜0.05；各治疗组系膜增生轻于模型组，P＜0.05；而真武汤大剂量组、真武汤小剂量组的系膜增生显著轻于尿毒清组，P＜0.05。3．10 Masson染色肾间质纤维化面积情况：模型组的纤维化面积最大，所占肾间质面积的百分比最高，与正常组比较，有显著差异，P＜0.05；真武汤大剂量组、真武汤小剂量组肾间质中纤维化面积显著低于模型组，P＜0.05；而尿毒清组的肾间质中纤维化面积虽然也低于模型组，但无显著差异，P＞0.05，真武汤大剂量组、真武汤小剂量组肾间质中纤维化面积显著低于尿毒清组，P＜0.05。3．11 Sirius red染色Ⅰ和Ⅲ型胶原的分布面积情况：模型组肾间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原分布面积较大，与正常组比较，有显著差异，P＜0.05。真武汤大剂量组、真武汤小剂量组、尿毒清组肾间质中Ⅰ型胶原分布面积显著小于模型组，P＜0.05；而真武汤大剂量组、真武汤小剂量组、尿毒清组的肾间质中Ⅲ型胶原分布面积显著小于模型组，P＜0.05。真武汤大剂量组、真武汤小剂量组肾间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原分布面积小于尿毒清组，但无显著差异，P＞0.05。4结论4．1真武汤能够改善大鼠整体状况，具有利尿、降低24h尿蛋白量、改善肾功能、改善肾性贫血、改善钙磷代谢等作用；能使肾小管扩张和炎性细胞浸润减轻，而且肾间质纤维化程度降低，Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维增生减轻，肾小囊腔代偿性扩张及肾小球系膜增生减轻。可见，真武汤对单侧肾切除后腺嘌呤性慢性衰竭大鼠肾脏的具有一定的保护作用。4．2真武汤大剂量组、真武汤小剂量组肾间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原增生明显减少，低于模型组，可见真武汤有抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维增生和促进其降解的作用，从而达到抗肾间质纤维化的作用，这可能是真武汤防治肾间质纤维化、延缓慢性肾衰竭发展进程的机制之一。但其进一步的作用机制有待今后深入研究。4．3实验结果显示，真武汤大剂量组对大鼠慢性肾衰竭的疗效优于真武汤小剂量组，但本实验仅设了两个剂量组，尚不能说明真武汤治疗慢性肾衰竭的有效剂量范围和量效关系。真武汤的君药为附子，为有毒中药，今后应进一步开展真武汤的毒理学研究和安全性评价。