慢性心力衰竭是各种心脏结构或功能疾病导致收缩和(或)舒张功能障碍,以致肺循环和(或)体循环淤血,器官、组织血流灌注不足的一种病理状态。心肌重构是心力衰竭发生发展的基本病理生理机制,是指心肌组织在损害、压力或容量负荷增加时,心肌细胞、非心肌细胞及细胞外基质发生的适应性改变。主要表现为心肌细胞的肥大、坏死、凋亡,成纤维细胞的增殖、分化,细胞外基质胶原纤维沉积。心肌纤维化使心肌细胞运动受限,导致心肌僵硬度增加及室壁顺应性下降,影响心脏的收缩及舒张功能。细胞外基质的过度沉积及成纤维细胞的表型转化是心肌纤维化的主要表现。胶原纤维是细胞外基质的主要结构蛋白,其中I型、III型胶原纤维是构成心肌胶原纤维网的主要成分。成纤维细胞是细胞外基质胶原纤维的主要分泌细胞,同时可分泌基质金属蛋白酶及其抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子。病理状态下成纤维细胞增殖并转化为肌成纤维细胞,其合成细胞外基质的能力显著增加。肌成纤维细胞与成纤维细胞的主要结构区别是能够特征性表达α-平滑肌肌动蛋白。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是降解细胞外基质成分的主要酶系,金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)是其内源性的抑制剂。MMPs与TIMPs之间的平衡是维持细胞外基质动态平衡的重要因素。MMP2、MMP9是发现最早且研究最为充分的基质金属蛋白酶,多项研究表明明胶酶(MMP2、MMP9)在压力负荷诱发心衰的心肌纤维化中发挥重要作用。TIMP1可发挥抑制多种MMPs作用,其中最主要为抑制MMP9活性。TGFβs(transforming growth factors,TGFβs)在调节细胞生长与分化、炎症反应、细胞外基质降解、胚胎发育、免疫调节等方面具有重要作用。目前在哺乳动物体内发现TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ1β2四种亚型,其中TGFβ1是最重要的促纤维化生长因子,活化的TGFβ1通过细胞表面受体系统介导发挥作用。Smad蛋白是介导TGFβ1细胞内信号转导的一簇细胞内信号蛋白,可分为受体调节型、协同型、抑制型。其中smad2和smad3属受体调节型,smad4为主要的协同型蛋白,smad6和smad7为主要的抑制型蛋白。活化的tgfβ1与细胞表面受体结合后,可与胞浆内的受体调节smad蛋白结合,使之磷酸化激活,再与协同型smad蛋白结合形成复合物,并移位至细胞核,与具有特异性序列的dna结合元件结合,从而激活或抑制特定基因的转录。smad3具有特异的dna连接区和激活区,在tgfβ1诱导心肌纤维化中发挥重要作用,可促进肌成纤维细胞转化、细胞外基质合成及调节基质金属蛋白酶及抑制剂的分泌。抑制型smad蛋白可抑制受体调节型smad蛋白与受体的结合及磷酸化,对信号转导起负性调控作用,其中smad7对tgfβ1信号转导的抑制能力较强。结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,ctgf)是一种富含半胱氨酸的分泌型蛋白,属于早期反应基因家族,机体多种组织和细胞在生理状况下可分泌基础量的ctgf,参与调节细胞增殖、发育及损伤修复。病理状态下ctgf在心肌组织异常表达,不仅具有直接促纤维化作用,而且还能作为tgfβ1/smad信号通路的下游因子,发挥促纤维化效应。心脏收缩力调节(cardiaccontractilitymodulation,ccm)是在心肌组织绝对不应期内给予的高强度电刺激,该刺激并不会引发心肌细胞再次除极产生电机械活动或影响心电传导顺序,但能够增强心肌的收缩力、改善心功能。既往基础研究表明ccm通过改善心肌组织胚胎基因的异常表达及调节钙离子转运相关蛋白表达及功能,从而发挥增强心肌收缩力作用。临床研究亦证实ccm可显著改善chf患者心功能,提高运动耐量及生活质量。本实验通过升主动脉缩窄法建立兔慢性心力衰竭动物模型,观察心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌纤维化的影响,并探讨其可能的机制。第一部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌纤维化的影响目的:通过升主动脉缩窄法建立兔慢性心力衰竭动物模型,观察心脏收缩力调节对心衰心肌纤维化影响。方法:30只新西兰大白兔随机分为三组:假手术组(n=10)、心衰组(n=10)、心衰+ccm组(n=10)。心衰组、心衰+ccm组动物开胸后于升主动脉根部远端1.0cm处行环扎缩窄术,经12周建立慢性心衰动物模型。心衰+ccm组术中于左心室前壁预置小儿临时起搏电极,并于造模成功后连续给与4周ccm刺激。测定超声心动图指标及血bnp水平,并行心肌组织he染色、masson染色、天狼星红染色及心肌组织羟脯氨酸测定,观察ccm对慢性心力衰竭兔心肌组织纤维化的影响。结果:1动物模型存活情况假手术组中10只动物仅开胸,未行升主动脉缩窄术,术后全部存活;心衰组中1只实验动物因术中出现气胸死亡;心衰+ccm组中1只实验动物因术中出血死亡。术后12周各实验动物均存活,且心衰组、心衰+ccm组实验动物均满足血流动力学测定的心衰标准,同时表现出食欲减退、精神萎靡、活动减少、呼吸频率增加。术后16周各组试验动物均存活。最终共28只试验动物数据纳入统计分析,假手术组(n=10)、心衰组(n=9)、心衰+ccm组(n=9)。2各组试验动物心脏超声指标术前三组实验动物超声各项指标无明显差别(p>0.05)。术后12周时心衰组及心衰+ccm组lvesd和lvedd较假手术组升高(p<0.05),而lvef、lvfs和e/a比值在心衰组与心衰+ccm组均比假手术组下降(p<0.05)。术后16周时心衰+ccm组心功能较心衰组改善,差异有统计学意义(p<0.05)。3bnp与假手术组相比,术后12周时心衰组及心衰+ccm组实验动物血bnp水平升高(p<0.05)。术后16周时,与心衰组相比,心衰+ccm组试验动物血bnp水平下降,但仍高于假手术组(p<0.05)。4病理学检查4.1he染色假手术组实验动物心肌组织肌纤维排列有序,细胞形态一致,细胞胞质染色均匀。心衰组心肌组织肌纤维排列紊乱、肌细胞呈现不同程度变性、坏死及淋巴细胞浸润。心衰+ccm组心肌组织的表现较心衰组改善。4.2masson染色假手术组心肌组织肌纤维排列整齐,无明显胶原纤维增生表现;心衰组心肌组织中胶原纤维明显增生,呈网状分布;ccm组心肌组织中心肌组织胶原纤维增生较心衰组下降,胶原纤维面积较心衰组减少。心衰组心肌胶原容积分数(cvf)较假手术组明显增加(p<0.05),ccm可改善心衰心肌组织cvf(p<0.05)。4.3天狼猩红染色与假手术组相比,心衰组心肌组织心肌胶原纤维含量增加。ccm可减轻心衰心肌组织胶原纤维含量。5心肌组织羟脯氨酸心衰组心肌组织羟脯氨酸含量增加,与假手术组相比差异有统计学意义(p<0.05);心衰+ccm组心肌组织羟脯氨酸含量下降,与心衰组相比差异有统计学意义(p<0.05)。第二部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌胶原纤维代谢影响目的:观察ccm对心肌组织中i型胶原纤维、iii型胶原纤维、α-sma、mmp2、mmp9、timp1蛋白表达影响,探讨ccm对慢性心力衰竭兔心肌组织胶原纤维代谢影响。方法:应用免疫组化及蛋白印迹技术,测定各组心肌组织中i型胶原纤维、iii型胶原纤维、α-sma、mmp2、mmp9、timp1蛋白的表达水平。结果:1免疫组织化学染色法观察α-sma蛋白表达α-sma蛋白阳性表达产物呈棕黄色颗粒主要位于心肌细胞胞浆。与假手术组相比,心衰组心肌组织中α-sma蛋白阳性表达产物增加[(24.50±2.46)%比(39.89±2.62)],差异有统计学意义(p<0.05);ccm可下调心衰心肌组织中α-sma蛋白阳性表达产物[(39.89±2.62)%比(31.67±1.50)%],差异有统计学意义(p<0.05)。2ccm刺激对心肌组织i型胶原纤维、iii型胶原纤维、mmp2、mmp9、timp1、α-sma蛋白表达影响i型胶原纤维、iii型胶原纤维、mmp2、mmp9、timp1、α-sma蛋白在心衰组心肌组织中表达水平升高,与假手术组相比有统计学差异(p<0.05)。ccm使下调心衰心肌组织中i型胶原纤维、iii型胶原纤维、mmp2、mmp9、timp1、α-sma的蛋白表达水平,与心衰组相比有统计学差异(p<0.05)。第三部分心脏收缩力调节对慢性心力衰竭兔心肌组织tgfβ1/smad信号通路影响目的:观察ccm对心肌组织tgfβ1、smad3、smad7、ctgfmrna及蛋白表达影响,探讨CCM对TGFβ1/Smad3信号通路影响。方法:应用实时荧光定量聚合酶链反应及蛋白印迹技术,测定各组心肌组织中TGFβ1、Smad3、Smad7、CTGF mRNA及蛋白表达。结果:1 CCM对心肌TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA及蛋白表达影响TGFβ1、Smad3 mRNA及蛋白在心衰组心肌组织中表达水平升高,与假手术组相比有统计学差异(P<0.05)。与心衰组相比,CCM下调心衰心肌组织中TGFβ1、Smad3 mRNA及蛋白的表达水平,有统计学差异(P<0.05)。Smad7 mRNA及蛋白在心衰组心肌组织中表达降低,与假手术组相比有统计学差异(P<0.05)。CCM组心肌组织中Smad7 mRNA及蛋白表达水平上调,与心衰组相比有统计学差异(P<0.05)。2 CCM对心肌CTGF mRNA及蛋白表达影响CTGF mRNA及蛋白表达水平在心衰组心肌组织中表达水平升高,与假手术组相比有统计学差异(P<0.05)。与心衰组相比,CCM使下调心衰心肌组织中CTGF mRNA及蛋白表达,有统计学差异(P<0.05)。结论:1升主动脉套扎法可成功建立慢性心力衰竭兔心衰动物模型,心衰心肌组织中I型胶原纤维及III型胶原纤维沉积增加、成纤维细胞向肌成纤维细胞转化增加及MMP2、MMP9、TIMP1异常表达。其中TGFβ1/Smad信号转导通路在心力衰竭兔心肌纤维化进程中发挥重要作用。2 CCM可改善慢性心力衰竭兔心肌舒缩功能,减轻心肌纤维化,改善心衰心肌组织中MMP2、MMP9、TIMP1异常表达,降低肌成纤维细胞转化,减少心衰心肌组织中I型胶原纤维及III型胶原纤维过度沉积。CCM改善心肌纤维化的机制可能是抑制心力衰竭兔心肌组织中TGFβ1/Smad信号转导。