腐败梭菌(Clostridium septium)是一种革兰氏阳性厌氧杆菌，可引起动物和人的恶性水肿病、肌肉坏死、气性坏疽病以及坏死性肠炎等疾病，也是引发羊快疫的病原菌。该菌可分泌、β、γ和等多种外毒素，其中毒素是其主要的致病性毒力因子和免疫保护性抗原。本研究根据GenBank中已经登录的腐败梭菌毒素的基因序列，设计了3对引物，利用PCR技术扩增得到了毒素的全基因csa和两种截短毒素的基因csan219、csac439。分别将PCR扩增产物经酶切和连接，克隆到原核表达载体pET-28a（+）上，构建出了原核表达重组质粒pET28a-csa、pET28a219和pET28a439，转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），得到了重组大肠杆菌BL21（pET28a-csa）、BL21（pET28a219）和BL21（pET28a439），经PCR、双酶切以及序列测定等方法证实了表达载体构建成功。表达产物经SDS-PAGE检测显示，重组大肠杆菌能够有效地表达重组毒素和两种截短毒素，重组蛋白均以包涵体和可溶性两种形式表达，且以包涵体形式表达为主。优化后的重组大肠杆菌BL21（pET28a-csa）表达重组毒素的条件为：将重组大肠杆菌培养至对数生长中后期，菌液OD600达到0.850~0.950时，加入0.40mmol/L的IPTG，37℃诱导5~6h，重组毒素的表达量可达到最佳，为菌体总蛋白的25.0%。参考重组毒素的诱导表达条件，分别诱导重组大肠杆菌BL21（pET28a219）和BL21（pET28a439）对两种截短毒素的表达，截短毒素CSAN219和CSAC439的表达量分别可以达到34.0%和17.0%表达产物的Western-blot检测结果表明，重组毒素和两种截短毒素均能与腐败梭菌抗毒素发生特异性反应。小鼠毒性试验显示，重组毒素对小鼠有致死毒性，这种致死毒性可被腐败梭菌抗毒素中和；但是两种截短毒素对小鼠没有致死的毒性。细胞毒性试验表明，重组毒素具有细胞毒性，而截短毒素不具有细胞毒性。此外，溶血试验证实，重组毒素和两种截短毒素均不具备溶血活性。以氢氧化铝胶为佐剂，制备了重组毒素、两种截短毒素以及重组毒素不同表达形式的灭活疫苗。用重组毒素灭活菌苗以0.25mL/只（有效抗原含量约0.11mg）的剂量免疫家兔，21d后用腐败梭菌天然毒素攻毒，可使免疫家兔获得100%的保护，表明重组毒素具有很好的免疫原性；分别用两种截短毒素灭活菌苗以1.0mL/只的剂量（有效抗原含量约1.05mg和0.58mg）免疫家兔，家兔不能抵抗天然毒素的攻击，表明这两种截短毒素免疫原性较差，对家兔不能提供有效的免疫保护。对免疫后家兔的血清中和效价进行测定，其结果与免疫攻毒保护试验结果一致，能够抵抗天然毒素攻击的家兔其血清中和效价较高；实验还证明，用经超声波破碎处理和不经超声波破碎处理的重组毒素的全菌苗免疫的兔血清中和效价相近；用重组毒素全菌苗免疫的兔血清中和效价高于用超声波破碎上清苗和超声波破碎沉淀苗免疫的兔血清中和效价。不同免疫剂量的家兔免疫试验表明，随着重组毒素全菌苗免疫剂量的增加，免疫兔血清中和效价也随之增加。另外，用重组毒素全菌苗0.50mL/只免疫绵羊，攻毒后有75%的绵羊得到了保护。综上，重组腐败梭菌毒素可以作为预防腐败梭菌病的候选疫苗。