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目的:本课题首先研究三种动物血栓模型来初步揭示毛冬青总提取物的抗血栓作用,然后分别利用角叉菜胶模型,研究毛冬青总提取物对血管内皮的影响;并利用FeC13诱导血栓形成模型,研究毛冬青总提取物对P2Y12受体αGi亚单位和βγ亚单位功能的影响,以进一步探讨基于P2Y12受体的毛冬青总提取物的抗血栓作用机制,为寻找毛冬青抗血栓的作用靶点提供有力的科学依据,也为心血管疾病的防治及新药的研究开发提供新思路。方法:1.通过胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓、角叉菜胶诱导小鼠体内血栓以及FeC13诱导大鼠腹主动脉血栓模型,研究毛冬青总提取物的抗血栓作用。1.1胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成实验KM小鼠随机分成6组,即正常对照组、模型对照组、阿司匹林组、毛冬青总提取物高、中、低剂量组,每天灌胃给药一次,连续5 d。于第5 d末次给药45 min后,除正常对照组外,其余5组每鼠尾静脉注射胶原蛋白和肾上腺素的混悬液,正常对照组注射相同体积的生理盐水。观察并记录注射后5 min内小鼠死亡数和15 min内小鼠偏瘫的未恢复数,偏瘫以小鼠翻正反射消失为标准。1.2角叉菜胶诱导小鼠体内血栓形成实验KM小鼠随机分成6组,即正常对照组、模型对照组、阿司匹林组、毛冬青总提取物高、中、低剂量组,每天灌胃给药一次,连续8 d,在第5 d灌胃给药1h后,各组小鼠背部皮下注射3%角叉菜胶溶液诱发血栓,正常对照组于背部皮下注射生理盐水。观察注射角叉菜胶72 h后小鼠的黑尾发生率及黑尾长度。1.3 FeC13诱导大鼠腹主动脉血栓形成实验SD大鼠随机分成6组,即假手术组、模型对照组、肝素钠组、毛冬青总提取物高、中、低剂量组。除肝素钠组外,其余组每天灌胃给药1次,连续5 d。末次给药前12小时皮下注射肝素钠于肝素钠组,共给药2次,间隔时间为6小时。末次给药30 min后,所有大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后剖腹,分离腹主动脉段,其下置保护薄膜,将完全浸透FeC13的滤纸片环抱于分离的腹主动脉段上。50 min后去除纸片,在滤纸环抱处大约截取1.0 cm长血管段,吸干血管中的残留血液后称重,然后取出血栓后的血管再称重,前后两者相减即为该1.0cm长血管段内血栓的重量。2.毛冬青总提取物对角叉菜胶诱导小鼠体内血栓实验中血管内皮功能的影响KM小鼠随机分成温控和阻断后反应性充血(Postocclusion Reactive Hyperaemia,PORH)两批,每批再随机分为6组,即正常对照组、模型对照组、硝苯地平组、毛冬青总提取物高、中、低剂量组。实验操作按照方法“1.2”进行,观察造模72 h后小鼠的黑尾发生率和相对黑尾长度,同时用PeriFluxsystem5000激光多普勒血流仪检测温控、反应性充血(PORH)所致的血流变化。3.毛冬青总提取物对FeC13大鼠体内血栓实验中P2Y12受体αGi亚单位和βγ亚单位功能的影响SD大鼠随机分为6组,即假手术组、模型对照组、氯吡格雷组、毛冬青总提取物高、中、低剂量组。实验操作按照方法“1.3”,分离颈总动脉进行实验,称量血栓湿重,HE染色观察血栓形态学改变;检测血小板聚集率、凝血四项(PT、APTT、TT、FIB)和ADP受体(P2Y12)的表达水平;其次检测P2Y12受体两个亚单位(αGi、βγ)的功能:αGi亚单位包括环腺苷酸(cAMP);γ亚单位包括血栓素(TXB2)、前列环素(6-Keto-PGF1α)、P-选择素;最后检测血小板胞浆Ca2+和血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)的表达。结果:1.在胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成实验中,与模型组相比,毛冬青总提取物高、中、低(1、0.5、0.25 g/kg)各剂量组的小鼠的死亡和偏瘫数均降低,保护率提高;在角叉菜胶诱导小鼠体内血栓形成实验中,与模型组相比,毛冬青总提取物高、中、低(1、0.5、0.25 g/kg)各剂量组小鼠的相对黑尾长度均减少;在FeC13诱导大鼠腹主动脉血栓形成实验中,与假手术组相比,毛冬青总提取物高、中、低(0.78、0.39、0.195 g/kg)各剂量组形成血栓的湿重均减轻。2.在角叉菜胶诱导小鼠体内血栓形成实验中,毛冬青总提取物(125、62.5、31.25 mg/kg)各剂量组小鼠的相对黑尾长度均减少;造模前,各组随温度的变化,其血流百分变化值组间无差异性;造模后,与模型组比较,血流百分变化值加大;同样造模前,压力阻断前后,各组的血流变化值组间无差异性;造模后,与模型组比较,压力阻断前后,血流变化值降低;表明内皮损伤的程度减小,内皮的功能完善。3.在FeC13诱导大鼠体内血栓形成实验中,毛冬青总提取物(195、97.5、48.75 mg/kg)各剂量组均减轻形成血栓的重量和内皮受损程度;降低ADP诱导的血小板聚集率;降低FIB的含量及抑制P2Y12受体的表达,对APTT、TT、PT的表达几乎无影响;对αGi亚单位功能的影响是:提高cAMP的表达水平;对βγ亚单位功能的影响是:减少TXB2和P-选择素的含量、不影响6-Keto-PGF1α的表达;并降低血小板胞浆Ca2+平均荧光强度及抑制GPⅡb/Ⅲa的表达。结论:(1)毛冬青总提取物具有一定的抗动脉、静脉血栓的作用。(2)毛冬青总提取物能改善血管内皮的受损程度,具有保护血管内皮的作用。(3)毛冬青总提取物通过保护血管内皮,抑制血小板的聚集,最终抑制血栓的形成。(4)毛冬青总提取物通过影响P2Y12受体αGi亚单位和βγ亚单位功能的表达,降低P2Y12受体的含量,抑制血小板的聚集,最终抑制血栓的形成。