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树突状细胞（dendritic cells,DC）作为功能最强大的抗原呈递细胞（APC）,最大的特点是能够刺激初始（na（?）ve）T细胞增殖和启动机体免疫反应,在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中起关键作用。由于DC具有强烈的免疫激活作用,它的抗肿瘤功能成为近年来备受瞩目的热点。前期实验研究表明,以适当形式的肿瘤抗原加载的DC疫苗都能够激活抗原特异性T细胞识别、杀伤肿瘤细胞,从而产生特异性的抗肿瘤反应。但是进行DC的体外扩增及诱导成熟,操作复杂,重复性差,大大限制了它的应用。将特异性肿瘤抗原与单克隆抗体制备为融合蛋白,人为干预体内DC功能调节,以增强其T细胞活化功能是增强DC诱导特异性免疫应答的新方式,它利用单抗与DC的特异性结合而将肿瘤抗原定向给予（targeting delivery）到DC,使其被内吞,经加工处理后提呈于细胞表面,激活T细胞。但前期研究结果显示,这种融合蛋白非但没能诱导产生特异性免疫反应,反而在正常免疫力小鼠中诱导出免疫耐受,推测可能原因是非成熟DC（iDC）不能被激活形成成熟DC（mDC）,因而在外周诱导抗原特异性T细胞的清除和无能（anergy）。本研究在前期实验基础上,设计构建了新型DC靶向肿瘤疫苗FL-Fc-ctCD11c-TRP2180-188。FL是一种能够刺激早期造血的细胞因子,不仅能使骨髓增加生产DC的数量,而且可使DC的功能趋向成熟,使后者具有更强的抗原递呈和抗肿瘤作用。因此,可将FL作为刺激信号联合CD11c抗体（αCD11c）将黑色素瘤相关抗原肽TRP21801188定向给予DC。CD11c作为小鼠DC表面特异性标志,抗CD11c抗体具有特异靶向DC的作用,是体内DC修饰的理想载体。本研究主要探讨该融合蛋白的免疫作用途径及其对同系小鼠的抗肿瘤作用,包括以下几个方面:一、融合基因的克隆及表达载体的构建:利用基因工程技术,构建FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白的表达载体。首先用5′RACE技术获得仓鼠抗小鼠CD11c抗体（N418）轻、重链可变区序列,VH和VL经overlap PCR的方法获得单链抗体,并在3′末端通过（Gly4Ser）3连接TRP2180-188。FL-Fc融合基因已由本所构建,经overlap PCR通过（Gly4Ser）3在3′末端连接αCD11c-TRP2180-188,得到大小为2190bp的FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188的融合基因。将融合基因通过两端的酶切位点装入线性化的表达载体pcDNA3.1（+）,经酶切测序鉴定,成功构建融合基因的真核表达载体。二、融合蛋白的表达、纯化与体外靶向功能检测:通过脂质体法将FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188/pcDNA3.1（+）融合质粒转染CHO细胞,72 h后在上清中可检测到目的蛋白。通过筛选剂、Dot-Blot筛选出高表达克隆,经扩增及适应性无血清培养后,收集培养上清,Protein A亲和层析柱纯化得到FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白,SDS-PAGE和Western-Blot显示融合蛋白为三聚体,单体大小80 KDa。在体外扩增培养小鼠骨髓DC,在收获的细胞中,CD11c+细胞占90%,FACS结果显示融合蛋白能特异性结合DC细胞。三、融合蛋白的免疫增强作用:用FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白致敏C57BL/6小鼠,在免疫后8 h分离出淋巴结单个核细胞,其中CD11c+FL+、CD22c+CD86+细胞数量明显高于无关抗体对照组,表明FL-Fc-αCD11c-TRP2α180-188融合蛋白在体内可通过CD11c抗体靶向连接于DC,并可诱导DC的体外成熟。在免疫后7 d分离出的淋巴结单个核细胞,经负载抗原的DC刺激后可发生特异性T细胞的增殖,同时分泌IFNγ、TNFα等Th1型细胞因子,收获的CTL对表达TRP2的小鼠黑色素瘤细胞B16/F1有抗原特异性杀伤作用。结果表明FL-Fc-αCD11c-TRP2180-188融合蛋白能够特异性的增强机体免疫作用。四、融合蛋白对同系小鼠的预防和治疗作用B16/F1是表达TRP2抗原的小鼠黑色素瘤细胞株,将1×104个B16/F1细胞背部皮下接种C57BL/6小鼠,随机分3组,在接种后一周分别于皮下注射100μgFL-Fc-αtCD11c-TRP2180-188、FL-Fc与aCDl lc-TRP2180-lS8混合蛋白或等体积PBS,观察50天,并测量肿瘤大小。结果显示,FL-Fc-(CDl 1c-TRP2180-188组肿瘤生长明显受到抑制。各组小鼠经间隔一周的两次免疫后,接种1×10*个B16/F1,观察50天,并测量肿瘤大小。结果显示,FL-Fc-aCDl lc-TRP2180-lS8组成瘤率明显降低,肿瘤大小比对照组小。将未长肿瘤的小鼠处死,分离单个核细胞,与B16/F1细胞作用,发现有对B16/F1肿瘤细胞的特异性杀伤作用。综上所述,FL-Fc-aCDllc-TRP2180-188融合蛋白能通过CDllc抗体与细胞表面CDllc特异性的结合而将肿瘤抗原肽丁RP2定向给予到DC,FL则能够促进DC的成熟,进一步诱导T细胞的增殖和分化,激活机体抗肿瘤机制,对肿瘤细胞产生抗原特异性的杀伤作用。此种融合蛋白能够打破耐受,激活免疫系统,对同系小鼠具有预防和治疗肿瘤的作用,为抗肿瘤免疫治疗提供新的途径。