研究背景:　　 胰腺癌是最常见的侵袭性肿瘤之一,世界上胰腺癌导致的死亡占肿瘤死亡的第四位,5年生存率小于3％。高死亡率归因于发现晚、进展快和对放化疗耐受。吉西他滨是目前治疗进展期和转移性胰腺癌的一线化疗药物,而且对于改善临床症状已经取得了较好的临床疗效,但并没有显著提高生存率。因此寻找针对胰腺癌的新的治疗方案已经成为一项紧急的重任。　　 人类细胞microRNAs是一种内源性单链的大约22nt的非编码小RNA,与靶基因3端非编码区的种子结合位点以碱基互补的方式结合,在转录后水平调节靶基因的表达。microRNA在肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移中都发挥着重要的作用。有些microRNA已经被归类为癌基因或抑癌基因。功能学研究发现,microRNA异常表达可以引起肿瘤发生。近来,有几个研究小组报道了胰腺癌的microRNA表达谱,但是这些研究中分析的microRNA来源于整个肿瘤组织,而不是单纯直接来源于胰腺导管上皮癌细胞。miR-17-92家族位于C13orf25的第三个内含子,在许多肿瘤中发生杂合性缺失,如乳腺癌和肺癌。microRNA在不同的细胞类型中表达及发挥的功能不同。miR-17-92家族在B细胞系P493-6中通过下调E2F1的表达发挥抑瘤作用,但是在肺癌和淋巴瘤,miR-17-92家族表达增加并能加速肿瘤细胞的增殖。几个研究小组报道的miR-17-92家族在胰腺癌的表达情况各不相同。microRNA-20a是miR-17-92家族的一员。癌基因Stat3在原发胰腺癌中活性增强,发挥着不同的生理病理功能,包括诱导凋亡,调节细胞周期,促进肿瘤转移和新生血管生成。最近有文献报导Stat3的3端非编码区包含有microRNA-20a的结合位点,Stat3/microRNA-20a相互作用可以调节胚胎干细胞的分化。因此,我们有理由假设假设microRNA-20a在胰腺癌中可能是癌基因Stat3的一个有效的调节基因。　　 在本研究中,我们用荧光原位杂交和real time RT-PCR的方法分别验证了microRNA-20a在胰腺癌组织和细胞株Panc-1和BxPC-3中表达减少,而免疫组化验证了Stat3在胰腺癌组织和细胞中强阳性表达,与microRNA-20a负相关。进而我们用荧光素酶报告基因验证了microRNA-20a靶向Stat3的3端非编码区,在转录后水平负调节Stat3的表达,进而抑制了Stat3下游转移相关基因MMP2和VEGF的表达,在体内外试验中我们发现慢病毒介导microRNA-20a过表达能明显抑制胰腺癌细胞的增殖和转移,这为胰腺癌的治疗提供了新的思路和奠定了理论基础。　　 目的:本课题的研究目的是检测microRNA-20a在胰腺癌细胞中的表达情况,并进一步探索microRNA-20a在胰腺癌细胞增殖和转移中发挥的作用。　　 方法:　　 1、我们应用荧光原位杂交的方法检测10例胰腺癌组织和匹配的正常胰腺组织中microRNA-20a的表达情况。　　 2、用实时定量RT-PCR来检测两个低分化胰腺癌细胞株BxPC-3和Panc-1和永生化的正常胰腺导管上皮细胞H6C7中microRNA-20a的表达情况。　　 3、免疫组织化学检测胰腺癌组织和与之匹配的正常胰腺组织中Stat3的表达情况；免疫细胞化学检测BxPC-3、Panc-1和H6C7中Stat3的表达情况。　　 4、构建microRNA-20a的慢病毒表达质粒及其对照质粒,包装慢病毒,感染胰腺癌细胞BxPC-3和Panc-1,使其稳定过表达microRNA-20a,并同时设置对照。　　 5、细胞增殖实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验分析过表达microRNA-20a的胰腺癌细胞株、感染对照组细胞和母代细胞的体外增殖能力的影响；迁移和侵袭实验验证microRNA-20a的胰腺癌细胞株、感染对照组细胞和母代细胞的体外侵袭能力的影响；同时应用流式细胞仪分析细胞周期分布。　　 6、将过表达microRNA-20a的胰腺癌细胞株、对照组细胞和母代细胞分别作裸鼠移植瘤模型,分析microRNA-20a对胰腺癌细胞体内增殖能力的影响；另外将上述胰腺癌细胞株尾静脉注射裸小鼠,构建肺转移模型,分析microRNA-20a对胰腺癌细胞体内侵袭和转移能力的影响。　　 7、解剖小鼠后,去肺组织做活体成像,间接观察肺组织转移瘤情况；然后将肺组织石蜡包埋后切片,免疫组化染色,观察Stat3、MMP2和VEGF在肺转移瘤的表达情况。　　 8、Western blot检测过表达microRNA-20a的胰腺癌细胞、感染对照组细胞和母代细胞组Stat3、cyclin D1和MMP2等基因的蛋白的表达情况,ELISA检测细胞培养液上清中VEGF的量。　　 9、RT-PCR扩增Stat3 mRNA的3端非编码区,并诱导其突变体,分别连接到pGL3 control载体的Luc基因序列之后,与microRNA-20a mimics共转染胰腺癌细胞并设置对照组,用荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。　　 结果:　　 1、荧光原位杂交结果显示,与正常胰腺组织相比,microRNA-20a在胰腺癌组织中呈低表达状态；实时定量RT-PCR显示与永生化的正常胰腺导管上皮细胞相比,microRNA-20a在胰腺癌细胞株Panc-1和BxPC-3中表达明显下调(P<0.01)。　　 2、免疫组织化学和免疫细胞化学结果显示Stat3在胰腺癌组织和胰腺癌细胞株中强阳性,与microRNA-20a的表达呈负相关。　　 3、体外增殖实验和克隆形成实验证实microRNA-20a可显著地抑制胰腺癌细胞的增殖(P<0.01)；迁移和侵袭实验证实,microRNA-20a可显著地抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。　　 4、流式细胞周期分析发现,与对照组相比,microRNA-20a过表达显著改变了细胞周期的分布,使细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05),Western blot结果显示细胞周期蛋白cyclin D1在microRNA-20a过表达的胰腺癌细胞株中明显下调,而cyclin E蛋白水平没有明显变化。　　 5、动物实验证实microRNA-20a过表达在体内也显著抑制了胰腺癌细胞的增殖和转移(P<0.05)；肺组织活体成像显示,microRNA-20a过表达组肺组织内信号明显弱于对照组；转移瘤石蜡切片免疫组化染色显示Stat3、MMP2和VEGF阳性表达。　　 6、Western blot显示Stat3和MMP2蛋白水平在microRNA-20a过表达的胰腺癌细胞株中显著下调,ELISA结果显示microRNA-20a过表达的胰腺癌细胞培养上清中VEGF的水平显著下降(P<0.05)；而RT-PCR显示Stat3 mRNA水平没有显著变化,提示microRNA-20a是在转录后水平调节Stat3的表达。　　 7、荧光素酶报告系统结果显示将野生型Stat33端非编码区及其分别突变一个预测位点的突变体克隆到荧光素酶报告载体,再与microRNA-20a mimics共转染,均能显著抑制荧光素酶活性(P<0.01)；而将同时突变了两个预测位点的Stat33端非编码区克隆到荧光素酶报告载体,再与microRNA-20a mimics共转染,荧光素酶活性无明显改变(P>0.05)。这些结果说明,microRNA-20a预测的两个microRNA-20a结合位点均含有与microRNA-20a结合的种子区,　　 结论:　　 1、我们的研究说明了microRNA-20a在胰腺癌组织和细胞株Panc-1和BxPC-3中呈低水平表达,与Stat3蛋白的表达负相关。　　 2、用慢病毒感染的方法在胰腺癌细胞中稳定过表达microRNA-20a在体内外均能抑制胰腺癌细胞的增殖和转移。　　 3、microRNA-20a对胰腺癌细胞的增殖和转移的抑制作用可能是通过在转录后水平抑制癌基因Stat3和细胞周期蛋白cyclin D1的表达而实现的。　　 4、过表达microRNA-20a后负调节Stat3,使其表达水平下调,直接导致了Stat3下游转移相关基因MMP2和VEGF的表达受到抑制,从而抑制了胰腺癌细胞的侵袭和转移。　　 5、预测到的Stat33UTR两个位点经过检测都含有microRNA-20a的种子结合位点,microRNA-20a靶向Stat3的3端非编码区,在转录后水平负调节Stat3的表达,抑制了胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力,这为胰腺癌的治疗提供了新的思路。