论文部分内容阅读
【目的】探讨临床常见曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉)对经典的抗真菌药物伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B和新的抗真菌药物泊沙康唑、卡泊芬净的体外敏感性；建立应用实时荧光PCR技术将临床常见曲霉菌鉴定至种的水平。【方法】对所收集的真菌通过形态学和／或分子生物学鉴定,采用浓度梯度法(E-test)测定伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素B及卡泊芬净对5种曲霉菌的最低抑菌浓度(MIC)；采用液氮研磨、试剂盒纯化方法提取曲霉菌细胞核DNA,普通PCR方法扩增5种(47株)曲霉菌的内转录间隔区(ITS),测序获得ITS区序列,基于不同种曲霉菌的ITS区序列对种特异性探针进行验证和改进,建立实时荧光PCR方法将常见曲霉菌通过特异性探针解链温度(Tm)的差异进行区分并对该方法的灵敏度、特异性及重复性进行评价。【结果】形态学观察基本上能将临床常见的5种曲霉菌鉴定到种,对于其他种属形态学可以将其鉴定到属的水平,但是较难鉴定到种。卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉的MIC90均为0.094μg/ml,对黑曲霉的MIC90为0.19μg/ml,在5种药物中最低；泊沙康唑对土曲霉的MIC90最低,为0.094μg/ml;对于烟曲霉和黄曲霉,MIC90由低到高依次为卡泊芬净、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B；土曲霉对两性霉素B的MIC均>32μg/ml。MasterPureTM Yeast DNA Purification Kit提取的DNA量很低,固体培养+液氮研磨方法、液体培养+液氮研磨方法以及固体培养+液氮研磨+试剂盒纯化方法提取的DNA OD260/OD280的均值分别为1.73、1.96和1.80。烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉种特异性探针Tm值分别为61.4℃、57.4℃、67.7℃、65.8℃,土曲霉特异性探针的Tm值为64.5℃和55.2℃。实时荧光PCR方法对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的检测下限分别为56.8fg、1110fg、13.7fg、123fg、780fg。疣状瓶霉和小孢根霉能与烟曲霉特异性探针发生交叉反应。该方法在每次重复实验中Tm值的波动在0.5℃以内。【结论】形态学结合rDNAITS区测序对真菌种的鉴定很有帮助。Etest法体外药敏结果显示,新的棘白素类抗真菌药物卡泊芬净对五种曲霉具有很好的体外抗菌活性,唑类药物对于曲霉菌的体外抗菌活性优于两性霉素B。采用固体培养+液氮研磨法+试剂盒纯化法能获得高纯度的曲霉菌DNA。实时荧光PCR方法具有很好的灵敏度、特异性和重复性,能将临床常见的5种曲霉鉴定到种的水平。